黑腹果蠅抗菌肽基因Metchnikowin在畢赤酵母中分泌型表達(dá)及活性檢測(cè).pdf

1、抗菌肽是一類(lèi)具有抗菌作用的免疫活性物質(zhì)，是動(dòng)物非特異性免疫系統(tǒng)的重要組成部分。他們對(duì)細(xì)菌，真菌，病原蟲(chóng)以及癌細(xì)胞均表現(xiàn)出抗菌活性。近年來(lái)傳統(tǒng)抗微生物制劑的毒副作用及其耐藥菌株的出現(xiàn)，迫使人們?nèi)ふ倚滦偷目刮⑸镏苿etchnikowin 基因編碼的抗菌肽具有抗革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌性能。然而由于與傳統(tǒng)抗微生物制劑抗菌機(jī)理不同，該抗菌肽不會(huì)產(chǎn)生抗藥菌株，有潛力成為新品種的抗微生物制劑，具有廣闊的應(yīng)用前景。 本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)基因工程的

2、手段構(gòu)建出能夠穩(wěn)定表達(dá)Metchnikowin基因的畢赤酵母真核表達(dá)系統(tǒng)，大量獲得具有生物學(xué)活性的表達(dá)產(chǎn)物，并進(jìn)一步檢測(cè)利用真核系統(tǒng)中表達(dá)獲得該多肽的抗菌性，穩(wěn)定性，期望能為該抗菌肽在抗微生物制劑領(lǐng)域應(yīng)用提供理論依據(jù)。 本研究根據(jù)GeneBank中提交的序列，以果蠅總DNA模板，利用PCR技術(shù)，擴(kuò)增出兩端加入了連接接頭的 Metchnikowin 基因，將接頭處理成粘性末端，以便與經(jīng)過(guò)CpoI及Not I酶切后的pHBM 905

3、B表達(dá)載體正確連接。將Metchnikowin基因與分泌型酵母表達(dá)載體pHBM 905B連接，構(gòu)建成重組酵母表達(dá)載體pHBM 905B/Metchnikowin，經(jīng)“三明治”夾心平板篩選及菌落PCR鑒定證明目的基因已整合入酵母染色體中。挑選陽(yáng)性克隆菌株與100ml搖瓶中在甲醇誘導(dǎo)下大量表達(dá)，觀察表達(dá)量變化，以SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物，用瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)表達(dá)多肽的生物學(xué)活性，以及測(cè)試該表達(dá)多肽的熱穩(wěn)定性和PH值耐受性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該表達(dá)

4、多肽相對(duì)分子量約為6.5KD，證明與糖基化后預(yù)期分子量大小一致。用瓊脂糖擴(kuò)散法檢測(cè)上清液的生物學(xué)活性，觀察到明顯的抑菌圈，顯示其具有較強(qiáng)的抗革蘭氏陽(yáng)性菌和真菌活性，并且表達(dá)產(chǎn)物有極強(qiáng)的熱穩(wěn)定性，同時(shí)在不同PH值環(huán)境下仍能發(fā)揮抗菌活性。結(jié)果表明該種抗菌肽能很好的在畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)中得到表達(dá)，并且在進(jìn)一步的抗菌活性和穩(wěn)定性研究中發(fā)現(xiàn)該抗菌肽具有較強(qiáng)的抗菌活性，良好的熱穩(wěn)定性以及廣泛的PH值耐受性，這些特性使該抗菌肽具有非常誘人的應(yīng)用前景，并