探討TRPV1對M1型巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用及吳茱萸堿的干預(yù)作用.pdf

1、背景：近年來研究表明，在高血壓、冠心病、動脈粥樣硬化等心血管疾病發(fā)生與發(fā)展的不同階段，炎癥是其主要的、共同的病理生理學(xué)特征。心血管疾病往往是一種以血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷、單核/巨噬細(xì)胞浸潤為特征的慢性炎癥反應(yīng)性疾病。因此，抑制炎癥反應(yīng)可能成為當(dāng)今和未來治療心血管疾病有前途的方法之一。前期我們研究結(jié)果提示，瞬時(shí)受體電位香草酸亞型1（transient receptor potential vanilloid subfamilymember1,T

2、RPVl）具有抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞所介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)的功效，在此基礎(chǔ)上，探明TRPV1受體對單核/巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用，進(jìn)一步揭示TRPV1受體抗炎作用機(jī)制，對于防治心血管疾病及慢性炎癥反應(yīng)性疾病具有重要的基礎(chǔ)與臨床意義。
　　cell line，THP-1)培養(yǎng)模型上，通過觀察 TRPV1受體對脂多糖內(nèi)毒素（lipopolysaccharide，LPS）誘導(dǎo)THP-1分化為M1型巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生的細(xì)胞因子及其所表達(dá)的誘導(dǎo)型一氧化氮合酶

3、（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的影響，以及吳茱萸堿（Evodiamine，EVO）通過TRPV1受體對該過程的影響作用，從而闡明TRPV1受體對M1型巨噬細(xì)胞功能的調(diào)控作用及吳茱萸堿的干預(yù)作用，為進(jìn)一步揭示TRPV1受體及吳茱萸堿抗炎作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　目的：本研究在人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞(human acute monocyticleukemia
　　方法：
　　1

4、.將對數(shù)生長期的THP-1細(xì)胞以5×105/ml/well接種24孔板，待24小時(shí)后細(xì)胞長至80％以上開始進(jìn)行加藥刺激，實(shí)驗(yàn)分為以下6組：
　?、湃苊浇M：加入終濃度為1/20000的二甲基亞楓（dimethyl sulfoxide，DMSO）和Tween-80；
　?、芁PS+溶媒組：加入 LPS使其終濃度為1μg/ml，處理15分鐘后，加入終濃度為1/20000的DMSO和Tween-80；
　?、荂AP+LPS組：

5、先加入TRPV1特異性激動劑辣椒素（Capsaicin，CAP）使其終濃度為10umol/L，處理15分鐘后，再加入LPS使其終濃度為1μg/ml；
　　⑷CAPZ+CAP+LPS組：先加入TRPV1特異性拮抗劑辣椒卓平（Capsazepin，CAPZ）使其終濃度為10umol/L，處理15分鐘后，加入CAP使其終濃度為10umol/L，再處理15分鐘后，加入LPS使其終濃度為1μg/ml；
　?、蒃VO+LPS組：先加入E

6、VO使其終濃度為10umol/L，處理15分鐘后，再加入LPS使其終濃度為1μg/ml；
　?、蔆APZ+EVO+LPS組：先加入TRPV1特異性拮抗劑CAPZ使其終濃度為10umol/L，處理15分鐘后，加入EVO使其終濃度為10umol/L，再處理15分鐘后，加入LPS使其終濃度為1μg/ml；
　　2.收集各組上清液，利用ELISA法確定TRPV1受體對THP-1細(xì)胞在LPS刺激6小時(shí)和24小時(shí)后誘導(dǎo)分化為M1型巨噬細(xì)

7、胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子[腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-alpha,TNF-α）、白介素-6（interleukin-6,IL-6）和白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）]的影響。
　　3.收集各組培養(yǎng)細(xì)胞，利用Western-blot法確定TRPV1受體對THP-1細(xì)胞在LPS刺激6小時(shí)和24小時(shí)后誘導(dǎo)分化為M1型巨噬細(xì)胞所表達(dá)iNOS蛋白量的影響。
　　4.收集各組上清液，利用

8、 ELISA法確定吳茱萸堿通過 TRPV1受體對 THP-1細(xì)胞在LPS刺激6小時(shí)后誘導(dǎo)分化為M1型巨噬細(xì)胞所產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的影響。
　　每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次。
　　結(jié)果：
　　1.TRPV1受體對LPS所誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β的影響與溶媒組相比，THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激6小時(shí)和24小時(shí)后，細(xì)胞因子（TNF-α、IL-6和IL-1β）的產(chǎn)生明顯增加（P＜0.05

9、），利用 CAP激活 TRPV1受體后可明顯抑制 LPS的作用（P＜0.05），且該抑制作用可被 TRPV1受體的拮抗劑 CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
　　2. TRPV1受體對LPS所誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞表達(dá)iNOS蛋白量的影響與溶媒組相比，THP-1細(xì)胞經(jīng)LPS刺激6小時(shí)和24小時(shí)后，iNOS蛋白量的表達(dá)明顯增加（P＜0.05），利用CAP激活TRPV1受體后可明顯抑制 LPS的作用（P＜0.05），且該抑制作用可被TRPV1受體的拮抗劑

10、CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
　　3.吳茱萸堿通過 TRPV1受體對 LPS所誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的影響與溶媒組相比，THP-1細(xì)胞經(jīng) LPS刺激6小時(shí)后，細(xì)胞因子 TNF-α和IL-6的產(chǎn)生明顯增加（P＜0.05），利用EVO干預(yù)后可明顯抑制LPS的作用（P＜0.05），且該抑制作用可部分被TRPV1受體的拮抗劑CAPZ所逆轉(zhuǎn)。
　　結(jié)論：
　　1.在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)模型上，激活TRPV1受體后

11、能夠抑制 LPS所誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及表達(dá)iNOS的量，提示TRPV1受體可明顯抑制M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子及表達(dá)iNOS的能力。
　　2.在THP-1細(xì)胞培養(yǎng)模型上，吳茱萸堿能夠抑制LPS所誘導(dǎo)的M1型巨噬細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子的量，且該抑制作用可部分被 TRPV1受體拮抗劑所逆轉(zhuǎn)，提示吳茱萸堿可能通過激活TRPV1受體抑制炎癥反應(yīng)。
　　3.根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們推測 TRPV1受體可抑制M1型巨噬細(xì)胞的功能，以