布魯氏菌二元調(diào)控系統(tǒng)TceSR和TcfSR的生物學(xué)功能研究.pdf

1、布魯氏菌病是由感染人和動(dòng)物的布魯氏菌造成的對(duì)社會(huì)安全有嚴(yán)重危害的疾病，在世界上廣泛流行，尤其是在發(fā)展中國(guó)家，造成更為嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。布魯氏菌是一類兼性胞內(nèi)寄生菌，其毒力主要依賴于在宿主細(xì)胞內(nèi)的生存和繁殖的能力。二元調(diào)控系統(tǒng)（two-component regulatory system，TCS）能夠?qū)Νh(huán)境信號(hào)感受應(yīng)答、傳遞以及處理的信號(hào)進(jìn)行轉(zhuǎn)導(dǎo)、調(diào)節(jié)和控制。布魯氏菌有15對(duì) TCS，已有研究表明，位于染色體 I的 TCS與布魯氏菌的毒力

2、密切相關(guān)，但位于染色體 II的 TCS的毒力表型及其調(diào)控機(jī)制還尚不清楚。本研究以布魯氏菌 TCS TceSR和 TcfSR為研究對(duì)象，通過(guò)探討 TCS TceSR和 TcfSR對(duì)布魯氏菌毒力表型、相關(guān)基因表達(dá)和胞內(nèi)生存繁殖的影響，及其在小鼠體內(nèi)的毒力和免疫保護(hù)力，為揭示布魯氏菌感染宿主細(xì)胞的分子機(jī)制提供線索，也為新疫苗的研發(fā)、相關(guān)疫病的預(yù)防、控制和抗病育種工作提供依據(jù)。
　　目的：本研究以羊種布魯氏菌參考株16M為研究對(duì)象，探討

3、TCS TceSR和 TcfSR的功能及其在布魯氏菌致病過(guò)程中的作用機(jī)制。（1）構(gòu)建 TCS TceSR和 TcfSR啟動(dòng)子失活的突變株，并對(duì)其進(jìn)行鑒定。（2）分析 TCS TceSR和 TcfSR突變株相關(guān)毒力基因的胞內(nèi)外轉(zhuǎn)錄水平，比較突變株和親本株毒力基因表達(dá)的差異，根據(jù)差異基因的功能及其在突變株中的轉(zhuǎn)錄變化，解釋突變株相關(guān)毒力表型的變化。（3）分析比較突變株和親本株胞內(nèi)生存相關(guān)表型的差異，確定 TCS TceSR和 TcfSR對(duì)布

4、魯氏菌胞內(nèi)存活的作用。（4）分析突變株在小鼠體內(nèi)的毒力，探討 TCS TceSR和 TcfSR對(duì)布魯氏菌在小鼠體內(nèi)建立慢性感染的作用。
　　方法：（1）利用同源重組和抗性替換的方法，構(gòu)建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動(dòng)子失活的突變株；對(duì)獲得的基因突變株進(jìn)行 PCR鑒定和遺傳穩(wěn)定性檢測(cè)。（2）布魯氏菌侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7，qRT-PCR檢測(cè)布魯氏菌相關(guān)毒力基因（主要包括脂多糖合成相關(guān)蛋白、外膜蛋白、Ⅳ型分泌系統(tǒng)、轉(zhuǎn)

5、運(yùn)系統(tǒng)、鞭毛系統(tǒng)、調(diào)控系統(tǒng)、壓力蛋白/泛素相關(guān)蛋白、氮源代謝分子）的胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄水平；親本株和突變株在體外刺激環(huán)境中培養(yǎng)30min。利用 qRT-PCR分析毒力基因 omp25、virB1、vjbR、gntR、dnaK、Hfq、htrA的轉(zhuǎn)錄變化。（3）比較突變株和親本株的胞內(nèi)存活相關(guān)表型。布魯氏菌侵染小鼠巨噬細(xì)胞 RAW264.7，在侵染后不同時(shí)間，檢測(cè)細(xì)菌的黏附侵襲能力和胞內(nèi)存活能力；親本株和突變株侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7，利用熒

6、光定量 PCR、流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡測(cè)定宿主細(xì)胞在細(xì)菌的侵襲下所引起的凋亡和自噬水平；構(gòu)建能夠表達(dá)綠色熒光的布魯氏菌，侵染巨噬細(xì)胞 RAW264.7，觀察布魯氏菌與溶酶體的融合情況。（4）用布魯氏菌疫苗株和突變株分別腹腔接種免疫（106CFU）SPF級(jí)4-6周齡雌性 BALB/c小鼠；接種后的不同時(shí)間點(diǎn)采集免疫小鼠血清，采用間接 ELISA測(cè)定小鼠體內(nèi)細(xì)胞因子 IFN-γ的水平和總的 IgG水平；無(wú)菌分離脾臟，測(cè)定脾臟載菌量，制備病

7、理切片，檢測(cè)突變株的毒力；用105CFU的16M進(jìn)行攻毒實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)各菌株的保護(hù)力；克隆、表達(dá)、純化 TCES和 TCFS兩個(gè)蛋白，以純化的蛋白作為抗原，分別對(duì)突變株免疫小鼠的血清進(jìn)行 Western Blot分析。
　　結(jié)果：（1）成功構(gòu)建了 TCS TceSR和 TcfSR啟動(dòng)子突變株16MΔTceSR和16MΔTcfSR，在15代內(nèi)遺傳性穩(wěn)定；突變株和親本株的體外生長(zhǎng)趨勢(shì)一致；體外刺激結(jié)果顯示，突變株對(duì)酸、堿、高鹽、熱應(yīng)激、營(yíng)

8、養(yǎng)缺陷和干燥的抵抗力降低。（2）親本株和突變株侵染細(xì)胞24h后，66個(gè)布魯氏菌相關(guān)毒力基因在胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平發(fā)生了變化，其中在16MΔTceSR突變株中，41個(gè)（62.12％）基因高表達(dá)，25個(gè)（37.88%）基因低表達(dá)；在16MΔTcfSR突變株中，47個(gè)（71.21%）基因高表達(dá)，19（28.79%）個(gè)基因低表達(dá)；在體外刺激環(huán)境下，布魯氏菌胞內(nèi)存活相關(guān)的基因在突變株中的轉(zhuǎn)錄水平均低于在親本株中的轉(zhuǎn)錄水平。（3）突變株對(duì)細(xì)胞的粘附能力和

9、胞內(nèi)存活能力是減弱的；細(xì)胞凋亡研究發(fā)現(xiàn)，突變株與親本株引起宿主細(xì)胞凋亡程度相似；而細(xì)胞自噬結(jié)果卻發(fā)現(xiàn)，突變株引起細(xì)胞自噬水平低于親本株；溶酶體融合實(shí)驗(yàn)顯示，侵染細(xì)胞24h時(shí)突變株組胞內(nèi)的布氏小體與溶酶體融合率高于親本株組。（4）突變株免疫小鼠后，可誘導(dǎo)機(jī)體分泌 IFN-γ和 IgG，小鼠脾臟載菌量低于親本株，但仍存在一定的毒力；攻毒后，突變株免疫的小鼠對(duì)親本株可產(chǎn)生一定的免疫保護(hù)力；布魯氏菌重組蛋白 TCES和 TCFS可以作為診斷抗原