鳥分枝桿菌二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP基因的克隆及功能的初步分析.pdf

1、目的:
　　二元調(diào)控系統(tǒng)是廣泛存在于細菌中的信號傳導(dǎo)機制，在控制病原菌的致病力方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。病原菌在感染宿主的過程中，能通過該系統(tǒng)密切感受和響應(yīng)體內(nèi)外各種微環(huán)境的變化，進而調(diào)節(jié)各種基因表達以完成其致病過程。PhoP是分枝桿菌二元調(diào)控系統(tǒng)PhoPR中的反應(yīng)調(diào)節(jié)器，可以控制一系列靶基因轉(zhuǎn)錄的上調(diào)和下調(diào)，從而影響分枝桿菌的毒力及其在宿主巨噬細胞中的生存能力。鳥分枝桿菌是細胞內(nèi)寄生菌，在艾滋病晚期?？砂l(fā)生鳥分枝桿菌的擴散性感染

2、。為揭示鳥分枝桿菌的致病機制，本文擬克隆鳥分枝桿菌臨床分離株的二元調(diào)控系統(tǒng)PhoP基因，并初步研究PhoP調(diào)控靶基因啟動子的機制，為闡明鳥分枝桿菌在巨噬細胞的生存機理以及今后獲得潛在的藥物靶標(biāo)來治療鳥分枝桿菌病奠定基礎(chǔ)。
　　方法:
　　1.根據(jù)鳥分枝桿菌PhoP基因序列設(shè)計引物，以實驗室保存的鳥分枝桿菌臨床分離株的DNA作為模板，利用PCR技術(shù)擴增PhoP基因全長，與T載體連接后測序，對鳥分枝桿菌PhoP基因全長及其DNA

3、結(jié)合區(qū)進行序列分析。
　　2.根據(jù)PhoP DNA結(jié)合區(qū)序列設(shè)計引物，利用PCR擴增鳥分枝桿菌PhoP DNA結(jié)合區(qū)基因序列，與表達載體pGEX-4T-3連接后，轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21進行表達。利用SDS-PAGE電泳對重組蛋白進行檢測，利用Glutathione Agarose親和層析對重組蛋白進行分離純化，制備GST-PhoPDNA結(jié)合區(qū)蛋白。
　　3.根據(jù)鳥分支桿菌PhoP基因啟動子序列及其下游基因MAV_0127、P

4、hoU、Amt1和Amt2的啟動子序列，設(shè)計引物，利用PCR擴增上述基因啟動子片段（約270bp）。運用凝膠遷移率移動試驗(EMSA)分別檢測GST-PhoP DNA結(jié)合區(qū)蛋白與PhoP、MAV_0127、PhoU、Amt的啟動子序列結(jié)合的情況。
　　結(jié)果:
　　1.鳥分枝桿菌PhoP基因和氨基酸序列與結(jié)核分枝桿菌毒力株H37Rv的同源性分別為86％和94％。鳥分枝桿菌PhoP212位的氨基酸殘基（突變位點）為絲氨酸殘基，這

5、與結(jié)核分枝桿菌毒力株H37Rv相同。
　　2.從凝膠遷移率移動試驗(EMSA)可看出，鳥分枝桿菌PhoP蛋白能與PhoP，MAV_0127及Amt基因啟動子結(jié)合，不能與PhoU結(jié)合，
　　結(jié)論:
　　1.該鳥分枝桿菌臨床分離株與結(jié)核分枝桿菌H37Rv的PhoP有較高的同源性。且二者PhoP突變位點均為絲氨酸殘基，提示PhoP在鳥分枝桿菌中的作用機制有可能與結(jié)核分枝桿菌一樣。
　　2.PhoP蛋白不僅可以調(diào)控其下游