PPARγ下調(diào)在AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞TNF-α及MMP-13表達(dá)中的作用與機制研究.pdf

1、第一部分 AGEs對兔軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13表達(dá)的影響與意義。
　　 目的：以外源性晚期糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation endproducts，AGEs)為損傷因子，在體外培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，觀察AGEs對腫瘤壞死因子-α(tumor necrosisfactor-α，TNF-α)和基質(zhì)金屬蛋白酶-13(Matrix metalloproteinase13，MMP-13)的表達(dá)和影響，探討A

2、GEs與骨關(guān)節(jié)炎(Osteoarthritis，OA)的關(guān)系及可能的信號通路及機制。
　　 方法：在原代培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，(1)不同濃度的AGEs與軟骨細(xì)胞共孵育48h后檢測軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13 mRNA的表達(dá)情況；(2)AGEs受體(Receptor for advanced glycation end products，RAGE)的抗體(anti-RAGE)及核因子-κB(nuclear factor-κ

3、B，NF-κB)的特異性阻斷劑吡咯烷二硫代氨基甲酸酯(pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC)與軟骨細(xì)胞預(yù)孵12h后，再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h，檢測軟骨細(xì)胞TNF-α及MMP-13mRNA的表達(dá)；(3)不同濃度的AGEs與軟骨細(xì)胞共孵育48h后檢測軟骨細(xì)胞過氧化氫酶(Catalase，CAT)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性及丙二醛(Malondial

4、dehyde，MDA)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)水平。采用RT-PCR方法檢測TNF-α和MMP-13的mRNA表達(dá)量，試劑盒方法檢測CAT、SOD活性及MDA水平，熒光探針法檢測ROS水平。
　　 結(jié)果：(1)不同濃度的AGEs(1，10，25，50，100μg/ml)與軟骨細(xì)胞共孵育48h后，TNF-α及MMP-13 mRNA的表達(dá)較正常對照組明顯升高(P<0.05或P<0.01)，且

5、均以AGEs濃度為100μg/ml時作用最明顯；(2)Anti-RAGE(5μg/ml)與PDTC(0.1mmol/L)能顯著抑制由AGEs(100μg/ml)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞TNF-α及MMP-13表達(dá)增多(P<0.01)，而anti-RAGE(5μg/ml)和PDTC(0.1mmol/L)單獨處理組與正常對照組相比差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(3)不同濃度的AGEs(1，10，25，50，100μg/ml)與軟骨細(xì)胞共孵育48

6、h后，濃度依賴性地使軟骨細(xì)胞CAT、SOD活性降低，MDA、ROS含量增多，與正常對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)
　　 結(jié)論：AGEs能顯著刺激軟骨細(xì)胞TNF-a和MMP-13表達(dá)增多，誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞損傷，其機制與激活RAGE，誘導(dǎo)活性氧(ROS)生成增多，激活NF-κB信號通路有關(guān)。
　　 第二部分 AGEs對兔軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)的影響與機制。
　　 目的：在體外培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，觀察AG

7、Es對軟骨細(xì)胞過氧化物酶體增生物激活受體γ(Peroxisome proliferator-activatedreceptor-γ，PPARγ)表達(dá)的影響，探討AGEs與PPARγ的關(guān)系與機制。
　　 方法：在原代培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，(1)不同濃度的AGEs與軟骨細(xì)胞共孵育48h后檢測軟骨細(xì)胞PPARγ的表達(dá)情況；(2)軟骨細(xì)胞與AGEs共孵育不同時間后檢測軟骨細(xì)胞PPARγ的表達(dá)情況；(3)RAGE的抗體(anti-RA

8、GE)與軟骨細(xì)胞預(yù)孵1h后，再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h，檢測軟骨細(xì)胞PPARγ的表達(dá)情況；(4)不同濃度的絲分裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號路徑的阻斷劑(P38-MAPK阻斷劑SB203580，JNK-MAPK阻斷劑SP600125，ERK-MAPK阻斷劑PD98059)與軟骨細(xì)胞預(yù)孵30min，再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h，檢測軟骨細(xì)胞PPARγ的表達(dá)情況。用RT-PCR方法檢測PPARγ的mRNA

9、水平，用Western blot方法檢測PPARγ的蛋白含量。
　　 結(jié)果：(1)不同濃度的AGEs(1，10，25，50，100μg/ml)與軟骨細(xì)胞共孵育48h后，軟骨細(xì)胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量較正常對照組明顯降低(P<0.05)，AGEs濃度越高PPARγ的mRNA水平及蛋白含量越低；(2)軟骨細(xì)胞與100μg/ml AGE共孵育不同時間(0，3，6，12，24，48h)后，PPARγ的mRNA表達(dá)和蛋白含量均

10、隨時間的延長而降低，0h處理組與其他各組比較PPARγ的mRNA表達(dá)和蛋白含量差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；(3)Anti-RAGE(5μg/ml)+AGEs處理組軟骨細(xì)胞PPARγ的mRNA表達(dá)顯著高于AGEs(100μg/ml)處理組(P<0.05)；(4)P38-MAPK阻斷劑SB203580+AGEs和JNK-MAPK阻斷劑SP600125+AGEs處理組的軟骨細(xì)胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量明顯高于AGEs單獨處理

11、組(P<0.05)，阻斷劑濃度越高PPARγ的mRNA水平及蛋白含量越高；ERK-MAPK阻斷劑PD98059+AGEs處理組與AGEs單獨處理組比較，軟骨細(xì)胞PPARγ的mRNA水平及蛋白含量均無明顯差異(P<0.05)
　　 結(jié)論：1.AGEs可誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)下調(diào)，并具有濃度和時間依賴性；2.AGEs通過AGEs-RAGE-MAPK途徑實現(xiàn)對軟骨細(xì)胞PPARy表達(dá)下調(diào)；3.MAPKs家族中P38-MAPK和JNK

12、-MAPK信號通路參與了AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞PPARγ表達(dá)下調(diào)，ERK-MAPK信號通路與該效果無關(guān)。
　　 第三部分 PPARγ激動劑對AGEs誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13表達(dá)的影響與機制。
　　 目的：在體外培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，觀察PPARγ激動劑吡格列酮(pioglitazone)對AGEs誘導(dǎo)兔軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13表達(dá)的影響，進一步探討PPARγ表達(dá)下調(diào)在AGEs致骨關(guān)節(jié)炎的作用、機制

13、與意義。
　　 方法：在原代培養(yǎng)的家兔軟骨細(xì)胞模型上，不同劑量的吡格列酮(1，10，50μM)與軟骨細(xì)胞預(yù)孵2h后，再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h，(1)RT-PCR方法檢測軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13的mRNA水平，用Western blot方法檢測TNF-α和MMP-13的蛋白含量；(2)試劑盒方法檢測軟骨細(xì)胞CAT、SOD活性及MDA水平；(3)熒光探針法檢測軟骨細(xì)胞ROS水平；(4)免疫熒光染色法檢測軟

14、骨細(xì)胞的NF-κB-p65亞基轉(zhuǎn)運情況。
　　 結(jié)果：(1)不同劑量的吡格列酮(1，10，50μ M)+AGEs處理組軟骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13 mRNA水平及蛋白含量明顯低于AGEs處理組(P<0.05)，吡格列酮劑量越大TNF-α和MMP-13 mRNA水平及蛋白含量越低，50μ M匹格列酮+AGEs處理組及50μ M匹格列酮單獨處理組與正常對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(2)1、10、50μ M吡格列酮

15、與軟骨細(xì)胞預(yù)孵育1h后，濃度依賴性的拮抗由AGEs所致軟骨細(xì)胞CAT、SOD活性降低及MDA、ROS水平增高(P<0.05)，且均50μ M吡格列酮作用最明顯；(3)1、10、50μ M吡格列酮與軟骨細(xì)胞預(yù)孵育1h后，再加入100μg/mlAGEs共同孵育48h，軟骨細(xì)胞NF-κB P65的核轉(zhuǎn)位呈濃度依賴性明顯抑制，100μg/mlAGEs單純處理組則明顯高于正常對照組(P<0.05)。
　　 結(jié)論：1.存在一條AGEs誘導(dǎo)軟

16、骨細(xì)胞TNF-α和MMP-13表達(dá)增多的信號通路，即：AGEs→RAGE→ROS↑→激活MAPK(P38-MAPK和JNK-MAPK)→下調(diào)PPARγ→NF-κB活化→TNF-α和MMP-13↑；2.PPARγ下調(diào)在AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞TNF-a和MMP-13表達(dá)增多的信號通路中起到了重要作用；3.PPARγ激動劑吡格列酮能顯著抑制AGEs誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞TNF-a和MMP-13表達(dá)增多；4.吡格列酮通過抑制RAGE/ROS/NF-κB信號