含真核表達(dá)質(zhì)粒的營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌工程菌株作為基因治療口服遞送載體系統(tǒng)的研究.pdf

1、背景和目的：
　　利用腸道黏膜免疫系統(tǒng)特點(diǎn)（包括：分泌性免疫為主、口服正常菌群微生物耐受、黏膜記憶應(yīng)答弱和腸道內(nèi)正常菌群可向腸黏膜下移位等）和大腸桿菌內(nèi)移位性質(zhì)，將含有真核表達(dá)質(zhì)粒且具有破吞噬泡能力的菌壁營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌工程菌株補(bǔ)充入腸道，將真核表達(dá)質(zhì)粒傳遞給腸黏膜下細(xì)胞，使這些真核細(xì)胞分泌表達(dá)目的蛋白產(chǎn)生生物學(xué)效應(yīng)。
　　方法和結(jié)果：
　　第一部分：以非病理性大腸桿菌工程菌DH10B為基礎(chǔ)，利用pKD46介導(dǎo)的重組

2、系統(tǒng)和kan/kil兩次篩選系統(tǒng)，敲除其菌壁肽聚糖層重要成分（DAP）合成關(guān)鍵酶（ASD）基因，獲得無(wú)抗抗生素基因標(biāo)記的菌壁營(yíng)養(yǎng)缺陷型大腸桿菌菌株E.coli DH10BΔasd，并對(duì)所得菌株進(jìn)行性質(zhì)檢測(cè)，表型特征為菌壁營(yíng)養(yǎng)缺陷型，革蘭氏陰性桿菌，生化反應(yīng)為典型大腸桿菌代謝特征；抗性特征為具有原菌株鏈霉素抗性；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增值速度為21.1分鐘/代；在37℃條件下普通LB培養(yǎng)基中的半數(shù)裂解速度約為24小時(shí)等。
　　第二部分：構(gòu)建真核

3、表達(dá)質(zhì)粒（pDV_nirb_hly_cmv_gene），該質(zhì)粒承載有NirB啟動(dòng)子（原核低氧啟動(dòng)子）控制的hly基因表達(dá)盒，并進(jìn)一步將人促紅細(xì)胞生成素（EPO）基因和增強(qiáng)綠色熒光蛋白（EGFP）基因分別構(gòu)建入該質(zhì)粒CMV啟動(dòng)子之下，獲得真核表達(dá)質(zhì)粒（pDV_nirb_hly_cmv_epo和pDV_nirb_hly_cmv_egfp），并對(duì)所得質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，包括目的DNA測(cè)序，質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切圖譜分析，證實(shí)質(zhì)粒構(gòu)建正確；通過(guò)菌體還原

4、型SDS-PAGE、菌體Western blot、挖膜N-末端氨基酸序列實(shí)驗(yàn)測(cè)定證實(shí)LLO蛋白表達(dá)正確；通過(guò)轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pDV_nirb_hly_cmv_epo的細(xì)胞培養(yǎng)液的免疫斑點(diǎn)、還原型SDS-PAGE、挖膜N-末端氨基酸序列實(shí)驗(yàn)測(cè)定證實(shí)EPO蛋白表達(dá)正確；通過(guò)熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染pDV_nirb_hly_cmv_egfp質(zhì)粒細(xì)胞，證實(shí)綠色熒光蛋白（EGFP）表達(dá)等。
　　第三部分：將獲得的上述質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入E.coli DH10BΔa

5、sd，篩選獲得重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）和重組菌株 E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_egfp）。檢測(cè)重組菌株 E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）表型特征為菌壁營(yíng)養(yǎng)缺陷型，革蘭氏陰性桿菌，生化反應(yīng)為典型大腸桿菌代謝特征；抗性特征為具有鏈霉素抗性和卡那霉素抗性；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期增值速度為29.6分鐘/代；在37℃

6、條件下普通LB培養(yǎng)基中的半數(shù)裂解速度約為24小時(shí)等。
　　觀察BALB/c小鼠對(duì)菌株灌胃后的反應(yīng)，確定安全灌胃劑量，證實(shí)灌胃劑量小于2×109CFU/只為安全劑量。
　　重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_egfp）體外被小鼠腹腔吞噬細(xì)胞吞噬過(guò)程觀察，顯示小鼠腹腔吞噬細(xì)胞可主動(dòng)吞噬該細(xì)胞株并在熒光顯微鏡下觀察到表達(dá)EGFP細(xì)胞存在。激光掃描共聚焦熒光顯微鏡結(jié)果證實(shí)菌體可被吞入或侵襲入細(xì)

7、胞。
　　重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_egfp）體外轉(zhuǎn)染細(xì)胞（Caco-2細(xì)胞、Hela細(xì)胞、NIH/3T3細(xì)胞、Ana-1細(xì)胞、小鼠腹腔吞噬細(xì)胞）熒光顯微鏡下可以觀察到表達(dá)EGFP細(xì)胞存在。這些結(jié)果證實(shí)該重組菌株可將所含有的質(zhì)粒傳遞給被侵襲的細(xì)胞。流式細(xì)胞儀的檢測(cè)結(jié)果顯示，被轉(zhuǎn)染后表達(dá)EGFP細(xì)胞比例分別為0.5％、0.2%、0.2%、0.1%和0.2%，與細(xì)胞計(jì)數(shù)法測(cè)量結(jié)果一致。

8、
　　分別取使用重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）和重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_egfp）灌胃后BALB/c小鼠腸道組織進(jìn)行組織切片和免疫組化實(shí)驗(yàn)（抗LLO抗體），證實(shí)灌胃重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）的BALB/c小鼠腸道組織部分細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)有LLO蛋白存在，并且腸黏膜結(jié)構(gòu)完整，細(xì)

9、胞結(jié)構(gòu)清晰，說(shuō)明該重組菌菌體蛋白LLO被釋放入細(xì)胞基質(zhì)；灌胃重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_egfp）的BALB/c小鼠腸道組織細(xì)胞內(nèi)觀察到EGFP的表達(dá)，說(shuō)明重組菌在細(xì)胞基質(zhì)內(nèi)釋放了所含真核表達(dá)質(zhì)粒pDV_nirb_hly_cmv_egfp，并且所載的egfp基因進(jìn)行了表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)證實(shí)重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_gene）作為基因遞送系統(tǒng)，具

10、有向細(xì)胞基質(zhì)釋放內(nèi)容物的能力。
　　用重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）灌胃BALB/c小鼠，檢測(cè)小鼠網(wǎng)織紅細(xì)胞比例變化，實(shí)驗(yàn)組與空對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05，數(shù)據(jù)組間差別顯著，實(shí)驗(yàn)組的平均值為空對(duì)照組平均值的2.13倍。間隔21天后的再次灌胃后，實(shí)驗(yàn)組與空對(duì)照組比較，經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05，仍然差別顯著，實(shí)驗(yàn)組的平均值為空對(duì)照組平均值的約1.53倍。以上實(shí)

11、驗(yàn)證實(shí)遞送epo基因表達(dá)了EPO蛋白，所表達(dá)EPO蛋白發(fā)揮了生理作用。
　　組織活菌培養(yǎng)檢測(cè)重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）在BALB/c小鼠體內(nèi)的分布，顯示在最初的1小時(shí)內(nèi)肝臟中可檢測(cè)到活菌，腸系膜淋巴結(jié)（含部分腸系膜）可在檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)檢測(cè)到活菌，在其他位置未能檢測(cè)到活菌。用RT q-PCR法檢測(cè)重組菌株E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_epo）

12、所攜帶的質(zhì)粒，結(jié)果顯示質(zhì)粒向小鼠其他位置分布。以上兩實(shí)驗(yàn)證實(shí)灌胃重組菌株后，在吞噬細(xì)胞攜帶重組菌株通過(guò)門靜脈和腸道淋巴兩條途徑，向小鼠全身分布。多器官免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)質(zhì)粒pDV_nirb_hly_cmv_egfp表達(dá)位置，證實(shí)pDV_nirb_hly_cmv_egfp主要在肝臟和脾臟內(nèi)表達(dá)，其他器官偶有表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　綜上所述，本研究用同源重組技術(shù)和kan/kil反篩選系統(tǒng)獲得無(wú)引入篩選抗性基因的細(xì)菌壁營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株

13、 E.coli DH10BΔasd；構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pDV_nirb_hly_cmv_gene；篩選后獲得重組菌株 E.coli DH10BΔasd（pDV_nirb_hly_cmv_gene），經(jīng)本研究證實(shí)該重組菌可將所載目的基因傳遞給機(jī)體細(xì)胞，并生成治療用活性蛋白，達(dá)到一定的生物效應(yīng)；同時(shí)也證實(shí)了通過(guò)灌胃含質(zhì)?；罹苿?jīng)腸道黏膜進(jìn)行基因治療方案可行，如對(duì)載體菌進(jìn)行進(jìn)一步的改造，將具有較好的應(yīng)用前景。
　　與傳統(tǒng)基因治療向機(jī)體

14、注射載體不同，本研究是向機(jī)體胃腸道內(nèi)補(bǔ)充含質(zhì)?；罹苿?，利用自然界原有的細(xì)菌移位途徑，將目的基因傳遞給機(jī)體細(xì)胞，產(chǎn)生生物效應(yīng)。
　　本系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)為避免注射，同時(shí)還可以降低生產(chǎn)成本，方便儲(chǔ)存運(yùn)輸。
　　目前本研究的局限性為，目的基因表達(dá)量仍然有待進(jìn)一步提高。
　　此外，提出一個(gè)腸道黏膜免疫屏障強(qiáng)度自動(dòng)控制假說(shuō)，即在腸道黏膜免疫屏障完整的情況下，PP結(jié)可看作“腸道內(nèi)生物威脅強(qiáng)度的感受器”，以與腸道內(nèi)微生物等“接觸”的方式進(jìn)