Toll樣受體5與黏附侵襲性大腸桿菌LF82在炎癥性腸病發(fā)病中的作用研究.pdf

1、【背景和目的】
　　近年來炎癥性腸病(inflammatory bowel disease,IBD)的發(fā)病一直呈上升趨勢,但是病因不明,發(fā)病機制尚不清楚,且難以徹底治愈,嚴重影響生命健康。一般認為感染、環(huán)境等因素觸發(fā)了遺傳易感個體異常的腸道免疫反應,引起腸道持續(xù)的炎癥和組織破壞。腸道菌群作為重要的致病因素,直接或間接地參與了包括IBD在內的諸多消化系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展。其中黏附侵襲性大腸桿菌(adherent-invasive Es

2、cherichia coli,AIEC)是近年來受到廣泛關注的一種IBD可能致病菌,最具代表性的AIEC菌株是E.coli LF82。AIEC在IBD發(fā)生發(fā)展中的作用和機制尚未闡明,尤其其是否與機體的某些免疫異常狀態(tài)存在協(xié)同作用共同促進IBD的發(fā)病尚不清楚。Toll樣受體(Toll-like receptors-5)是能直接識別病原菌分子結構的一類模式識別受體,在機體抵御病原菌入侵的過程中起著重要作用。其中Toll樣受體-5(Toll-

3、like receptors-5,TLR5)可識別細菌鞭毛蛋白并與之結合,激活核因子活化B細胞κ輕鏈增強子(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB),進而刺激大量炎癥細胞因子產生,但TLR5參與炎癥反應的具體機制還有待進一步研究。本研究旨在明確AIEC菌株E.coli LF82在體外腸上皮屏障及體內的作用,并探討TLR5在此過程中扮演的角色

4、及可能的分子機制,從而為闡明特殊類型的腸道大腸桿菌在IBD發(fā)生、發(fā)展中的作用提供理論依據。
　　【方法】
　　1.利用 Caco-2細胞系模型建立體外腸上皮屏障,通過測定跨上皮細胞電阻(trans epithelial electrical resistance,TEER)觀察E.coli LF82對屏障完整性的影響,測定熒光黃通過率研究E.coli LF82對腸屏障通透性的影響,通過免疫熒光化學和Western blot觀

5、察E.coli LF82對細胞間緊密連接的影響,通過ELISA研究E.coli LF82對細胞培養(yǎng)上清中炎癥細胞因子的影響;
　　2.建立葡聚糖硫酸鈉(dextran sulfate sodium,DSS)誘導C57BL/10C小鼠實驗性結腸炎模型,造模前一周向實驗動物灌胃給予109CFU/天E.coli LF82,通過疾病活動性評價指標、組織學表現(xiàn)、結腸組織MPO活性研究比較E.coli LF82對IBD實驗動物的結腸炎癥作用,

6、通過透射電鏡和免疫熒光化學觀察小鼠結腸超微結構和細胞骨架的變化,通過糖原染色、天狼星紅染色分別評估小鼠粘液產生能力和纖維化程度,通過Bio-plex、實時定量PCR和Western blot測定血清、組織中炎癥細胞因子及炎癥反應通路相關分子的變化,通過免疫組織化學和Western blot檢測實驗小鼠體內TLR5的表達證實TLR5是否參與E.coli LF82的致病過程;
　　3.利用TLR5基因敲除小鼠探討TLR5對E.coli

7、 LF82作用的影響及可能機制。通過疾病活動性評價指標、組織學表現(xiàn)、超微結構、結腸組織MPO活性、糖原染色、天狼星紅染色及血清、組織中炎癥細胞因子的測定等比較感染了E.coli LF82的野生型小鼠和TLR5基因敲除小鼠對DSS造模的表現(xiàn),探討TLR5在E.coli LF82感染結腸炎小鼠致病過程中的作用。
　　【結果】
　　1.E.coli LF82可降低腸上皮細胞屏障跨上皮電阻TEER,增加腸上皮細胞屏障對熒光黃大分子的

8、通過率,改變腸上皮細胞屏障緊密連接蛋白的分布和含量,并且影響腸上皮細胞屏障TNF-α等炎癥細胞因子的分泌;
　　2.通過急性活動相關性指標評價發(fā)現(xiàn)E.coli LF82可加重DSS誘導小鼠結腸炎癥,導致小鼠結腸超微結構和細胞骨架的改變,E.coli LF82還可降低DSS誘導小鼠結腸粘液分泌能力,導致結腸組織纖維化程度增加,同時增加小鼠血清和結腸炎炎癥細胞因子的釋放,伴隨著磷酸化NF-κB P65、P38的表達上調以及TLR5 m

9、RNA和蛋白水平的升高;
　　3.相比野生型小鼠,E.coli LF82對DSS誘導TLR5KO小鼠的結腸炎癥程度加重更明顯,E.coli LF82可進一步增加DSS誘導TLR5KO小鼠結腸炎炎癥細胞因子的分泌釋放。經E.coli LF82處理后,TLR5KO小鼠結腸組織磷酸化P38表達升高,但是升高的程度比野生型小鼠要低,而磷酸化NF-κB P65的表達則變化不明顯。
　　【結論】
　　我們的研究證實E.coli L