多種核酸擴(kuò)增技術(shù)研究及其在線粒體DNA檢測(cè)中的應(yīng)用.pdf

1、人類線粒體基因組DNA分子為一個(gè)16569bp的雙鏈環(huán)狀DNA分子，該基因組與核基因組相互獨(dú)立又互相依存，線粒體有13個(gè)編碼基因，22個(gè)tRNA和2個(gè)rRNA，許多疾病都與線粒體基因組相關(guān)。線粒體又有獨(dú)特的母系遺傳特性，是研究生物起源和進(jìn)化的重要材料。K562細(xì)胞是人類慢性髓系白血病細(xì)胞，該細(xì)胞容易獲取，具有各種分化特性，是實(shí)驗(yàn)室研究的重要材料。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，各種測(cè)序手段相繼出現(xiàn)，人們?cè)讷@取遺傳序列信息方面更加方便，利用測(cè)序

2、手段研究線粒體基因組，對(duì)其進(jìn)行正確的拼接和后續(xù)的功能注釋在診斷線粒體疾病，保護(hù)生物學(xué)和群體遺傳學(xué)，以及確定線粒體在進(jìn)化上的地位都有重要作用意義。本論文以K562細(xì)胞線粒體基因組為研究對(duì)象，通過實(shí)驗(yàn)的方法設(shè)計(jì)了一組對(duì)比實(shí)驗(yàn)，分別用基于PCR的方法和基于多重置換擴(kuò)增的全基因組等溫?cái)U(kuò)增來獲得線粒體基因組，然后利用一代Sanger測(cè)序方法和二代Illumina測(cè)序方法對(duì)我們獲取的線粒體基因組進(jìn)行測(cè)序，最終獲得了K562細(xì)胞線粒體基因組序列信息。

3、
　　1、我們利用基于PCR的擴(kuò)增方法，通過文獻(xiàn)綜述和預(yù)實(shí)驗(yàn)最終確定了45對(duì)線粒體擴(kuò)增引物，對(duì)線粒體環(huán)狀DNA分子的全長(zhǎng)進(jìn)行無縫擴(kuò)增，每一個(gè)擴(kuò)增片段長(zhǎng)度不超過1000bp，每一個(gè)擴(kuò)增片段的上下游都有一段的overlap。然后對(duì)這些擴(kuò)增片段利用ABI的3730測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序，獲取每一個(gè)擴(kuò)增片段的序列信息。對(duì)于一代測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)，我們使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)的blast在線比對(duì)工具將我們的每一個(gè)擴(kuò)增fragment與人類線粒體標(biāo)準(zhǔn)參考基因組(

4、NC—012920.1)進(jìn)行比對(duì)，然后手動(dòng)對(duì)這些比對(duì)后的片段進(jìn)行手動(dòng)拼接，最終獲得了K562細(xì)胞線粒體的完整基因組。
　　2、我們利用基于多重置換擴(kuò)增的線粒體基因組等溫?cái)U(kuò)增方法對(duì)我們的K562細(xì)胞線粒體基因組進(jìn)行擴(kuò)增。我們使用QIAGEN公司的REPLI-g Mitochondrial DNA kit對(duì)我們的K562核酸樣本進(jìn)行擴(kuò)增，一般地線粒體DNA在提取過程中往往與核DNA很難分開，所以我們選擇對(duì)K562全基因組中線粒體DNA

5、進(jìn)行特異性擴(kuò)增。實(shí)驗(yàn)過程中我們對(duì)樣本進(jìn)行了不同程度的稀釋，發(fā)現(xiàn)將樣本稀釋到0.1個(gè)核DNA的單倍量級(jí)時(shí)（即3.3pg/uL），再進(jìn)行線粒體基因組擴(kuò)增后10組平行樣本中只有3個(gè)樣本擴(kuò)增出。根據(jù)我們的全基因組稀釋樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，在0.1個(gè)gDNA單倍量級(jí)時(shí)，線粒體DNA與gDNA的reads覆蓋度之比在4-16倍之間，這與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果比較類似，說明該線粒體基因組擴(kuò)增試劑盒滿足我們實(shí)驗(yàn)的要求。利用該試劑盒得到的線粒體基因組進(jìn)行了二代Il

6、lumina測(cè)序。
　　3、一代測(cè)序數(shù)據(jù)在比對(duì)過程中，我們發(fā)現(xiàn)了39個(gè)單堿基突變位點(diǎn)和一個(gè)短片段缺失，這些突變位點(diǎn)分布在線粒體基因組的全長(zhǎng)，包括rRNA、tRNA、D-Loop以及基因編碼區(qū)。我們將這些突變位點(diǎn)分為編碼區(qū)和非編碼區(qū)兩部分，對(duì)于編碼區(qū)的突變位點(diǎn)分為錯(cuò)義突變和無義突變分別討論相關(guān)的功能意義。我們利用的是NCBI基因數(shù)據(jù)庫(kù)、MITOMAP線粒體基因數(shù)據(jù)庫(kù)以及UniprotKB蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)我們的突變位點(diǎn)進(jìn)行查找，我們發(fā)現(xiàn)大

7、多數(shù)突變位點(diǎn)都已經(jīng)存在于這些數(shù)據(jù)庫(kù)之中，我們根據(jù)查找到的信息對(duì)每個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了功能注釋，分析總結(jié)了各位點(diǎn)的生物學(xué)意義。對(duì)于少量數(shù)據(jù)庫(kù)中查找不到的位點(diǎn)，我們利用Jpred蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)在線分析軟件分析了這些位點(diǎn)改變?cè)斐傻陌被岣淖冞M(jìn)而可能對(duì)整個(gè)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)造成的影響，并且分析了這種影響可能引起的功能變化。對(duì)于兩種不同方法獲得的線粒體基因組我們利用了二代Illumina測(cè)序方法進(jìn)行了測(cè)序，并對(duì)兩種方法得到的測(cè)序結(jié)果進(jìn)行了初步的比較，并且對(duì)一代測(cè)