桑樹(shù)韌皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的生物學(xué)功能研究.pdf

1、植物在長(zhǎng)期的進(jìn)化過(guò)程中形成了特有的信息交流網(wǎng)絡(luò)，韌皮部作為信號(hào)分子長(zhǎng)距離傳遞的主要通道，具有感應(yīng)環(huán)境信號(hào)、傳導(dǎo)系統(tǒng)信號(hào)的功能。韌皮部汁液中具有豐富的miRNA，汁液中的miRNAs作為一種重要的調(diào)控因子，在調(diào)控基因表達(dá)方面有非常廣泛的生物學(xué)功能。本研究根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組信息，克隆得到桑樹(shù)韌皮部汁液mul-miR482和mul-miR58的基因，采用定量PCR技術(shù)分析了其組織表達(dá)特性，并利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)研究了mul-miR482和mul-

2、miR58的生物學(xué)功能;利用Tail-PCR技術(shù)擴(kuò)增得到mul-miR482基因的啟動(dòng)子，通過(guò)GUS組織化學(xué)染色分析了其表達(dá)活性;采用擬南芥微嫁接技術(shù)對(duì)mul-miR482的可運(yùn)輸性進(jìn)行了分析。研究結(jié)果為揭示桑樹(shù)mul-miR482和mul-miR58的生物功能以及韌皮部介導(dǎo)的miRNA長(zhǎng)距離傳導(dǎo)的分子調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為桑樹(shù)功能基因組學(xué)研究提供了參考。
　　本文的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)桑樹(shù)韌皮部汁液mul-m

3、iR482的生物學(xué)功能分析
　　根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，利用PCR技術(shù)克隆得到桑樹(shù)mul-miR482的基因，命名為MulMIR482，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化了擬南芥。通過(guò)Northern-blot和熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MulMIR482基因能在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中高效表達(dá)并加工形成成熟體。Mul-miR482在擬南芥中表達(dá)使植株表型發(fā)生明顯變化，降低了轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力，提高了植株對(duì)丁香假單胞桿菌番茄致病變種(

4、Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，PstDC3000)的敏感性。因此，mul-miR482對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育具有一定的調(diào)節(jié)作用，并在植物對(duì)鹽分脅迫的響應(yīng)和抗病反應(yīng)過(guò)程中起著負(fù)調(diào)控作用。
　　(2)桑樹(shù)韌皮部汁液中mul-miR482的組織表達(dá)特性分析
　　利用Tail-PCR方法克隆得到MulMIR482的側(cè)翼序列共1937bp，分析發(fā)現(xiàn)該序列中包含23個(gè)順式作用元件，其中包含CAAT

5、-BOX和TATA-BOX啟動(dòng)子核心元件及其它多種轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件。構(gòu)建該啟動(dòng)子啟動(dòng)GUS基因的植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化擬南芥，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行GUS組織化學(xué)分析，結(jié)果顯示pmiR482-GUS在植株的莖和花中表達(dá)量高，在根中表達(dá)量很低，而在葉片和果莢中則不表達(dá)，表明MulMIR482基因表達(dá)有組織特異性;利用熒光定量PCR對(duì)mul-miR482成熟體的組織表達(dá)特性分析發(fā)現(xiàn)，mul-miR482成熟體在桑樹(shù)根、果實(shí)、樹(shù)皮和葉

6、片中均有表達(dá)，表明mul-miR482成熟體的積累沒(méi)有組織特異性，但其在不同組織和器官中的豐度具有明顯差異，在根組織中的豐度最高，而在葉片中的豐度最低。
　　(3)桑樹(shù)韌皮部汁液mul-miR482的運(yùn)輸性分析
　　分別以轉(zhuǎn)基因幼苗和野生型幼苗做砧木（或接穗）和接穗（或砧木）進(jìn)行嫁接，利用熒光定量PCR分析砧木與接穗部分中mul-miR482表達(dá)豐度。分析結(jié)果表明，mul-miR482在植物體內(nèi)可以上下雙向運(yùn)輸，但由上往下運(yùn)

7、輸量大于由下往上的運(yùn)輸量或者主要是由上往下進(jìn)行運(yùn)輸。
　　(4)桑樹(shù)韌皮部汁液mul-miR58的生物學(xué)功能分析
　　利用PCR技術(shù)克隆得到桑樹(shù)mul-miR58的基因，命名為MulMIR58，熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)mul-miR58在桑樹(shù)根、果實(shí)、樹(shù)皮均有很高的表達(dá)量，而在葉片中的表達(dá)量極低。將MulMIR58轉(zhuǎn)入擬南芥獲得了轉(zhuǎn)基因植株，通過(guò)Northem-blot和熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn)MulMIR58基因能在轉(zhuǎn)基因擬南