miR-1011和miR-318在DNA損傷應答的功能.pdf

1、基因組的穩(wěn)定性不斷地被DNA損傷挑戰(zhàn)，每天每個細胞遭受數(shù)十萬次DNA損傷事件。這些DNA損傷事件由正常細胞代謝廢物或者DNA復制壓力導致，也可以由輻射和環(huán)境中化學毒物導致。在淋巴細胞和生殖細胞，DNA損傷也可能由基因組重排引起。DNA損傷可以干預DNA復制和轉錄，并導致基因突變和染色體斷裂紊亂。DNA損傷應答系統(tǒng)維持著基因組的穩(wěn)定性，消除DNA損傷的不利結果，阻止它們向子代細胞傳遞。DNA損傷應答系統(tǒng)的缺陷將導致衰老和各種紊亂包括發(fā)育缺

2、陷、退行性神經性疾病和腫瘤的發(fā)生。因此，一個有效的DNA損傷應答系統(tǒng)對于細胞和有機體的生存是非常重要的。
　　miRNA是一種大小約18bp～22bp、非編碼RNA分子。miRNA主要通過結合靶基因mRNA3'UTR區(qū)域的miRNA結合元件來調節(jié)靶基因轉錄后水平，其調節(jié)靶基因轉錄后沉默通過同源mRNA的特異性切割或者特異性抑制蛋白質合成兩種方式。近來研究鑒定出了miRNA成熟所必需的多種亞單位蛋白復合體并將其命名為微處理器。微處理

3、器包括:Drosha、RNaseⅢ核酸內切酶和DGCR8。據(jù)預測在人類大約有2000個miRNA，超過900個miRNA已經被證實，調節(jié)人類30％的基因。miRNA除了在正常發(fā)育和細胞生理過程中發(fā)揮著重要的功能，隨著研究發(fā)現(xiàn)miRNA功能的紊亂有助于人類疾病的發(fā)生，其紊亂可以導致神經退行性疾病、腫瘤、心腦血管疾病等一系列疾病的發(fā)生。DNA損傷時DNA損傷應答基因在轉錄水平和轉錄后水平被調節(jié)。miRNA作為一個非編碼RNA，在DNA損傷時

4、也可以轉錄和轉錄后水平被調節(jié)。
　　目的:
　　有大量研究已經在體外對DNA損傷時miRNA的功能進行了研究。然而，在果蠅體內miRNA對DNA損傷反應還缺乏系統(tǒng)性研究。本研究以果蠅為模型，初步分析了miRNA在DNA損傷應答中的功能。
　　方法:
　　1本實驗室前期實驗人員通過RNA-seq方式篩選出了46個p53依賴性和非依賴性差異表達的miRNAs。
　　2利用分子克隆技術構建了miRNAs gRNA

5、質粒和miRNAs轉基因質粒。
　　3通過離子輻照敏感性實驗，研究了mir-1011、mir-318、mir-278、mir-8、mir-932、mir-274、mir-9c、mir-375果蠅突變體對DNA損傷敏感性檢測。
　　4通過BrdU染色實驗，檢測了miR-1011和miR-318突變對G1/S細胞周期檢驗點的影響。
　　5通過PH3染色實驗，檢測了miR-1011和miR-318突變對G2/M細胞周期檢驗點

6、的影響。
　　結論:
　　1本實驗成功構建21個miRNAs gRNA質粒和22個miRNAs轉基因質粒。
　　2通過γ-輻照敏感實驗，本實驗發(fā)現(xiàn)mir-1011、mir-318、mir-278突變果蠅對輻照非常敏感;mir-8突變果蠅對輻照微弱敏感;mir-932突變果蠅對輻照產生抵抗;mir-274、mir-9c、mir-375突變果蠅對輻照不敏感。
　　3本實驗發(fā)現(xiàn)mir-1011主要通過調節(jié)G1/S細胞周