桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs的生物學(xué)功能研究.pdf

1、桑樹(shù)黃化型萎縮病是由植原體引起的一種桑樹(shù)毀滅性病害，嚴(yán)重影響了蠶業(yè)生產(chǎn)的發(fā)展。目前有關(guān)植原體致病的分子機(jī)制仍不清楚。植物的miRNA作為一種重要的調(diào)控因子，在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及環(huán)境響應(yīng)等方面都扮演著十分重要的角色。本研究利用PCR技術(shù)克隆得到3個(gè)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs(mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33)基因，并對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行了研究，初步明確了這3個(gè)miRNAs在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程

2、中的作用，為揭示基于miRNA水平上的桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的調(diào)控機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，對(duì)于促進(jìn)桑樹(shù)功能基因組學(xué)研究及豐富和發(fā)展miRNA的生物學(xué)功能具有重要意義。
　　本文的主要研究結(jié)果如下:
　　(1)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs的表達(dá)差異顯著性驗(yàn)證
　　根據(jù)桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序得到的3個(gè)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs的基因序列，利用Northern blot和熒光定量PCR的方法對(duì)其在受植原體侵染葉片和健康桑樹(shù)葉片中

3、的表達(dá)差異顯著性進(jìn)行了驗(yàn)證。結(jié)果顯示，桑樹(shù)受植原體侵染后，mul-miRn8的表達(dá)量顯著上升，mul-miRn26和mul-miRn33的表達(dá)量均顯著降低。
　　(2)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs基因在擬南芥中的異源表達(dá)分析
　　根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，通過(guò)PCR技術(shù)克隆得到mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33的基因，分別命名為MulMIRn8、MulMIRn26和MulMIRn3，構(gòu)建

4、了其植物表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化了擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。通過(guò)Northern雜交分析發(fā)現(xiàn)MulMIRn8、MulMIRn26和Mul MIRn33基因均能在轉(zhuǎn)基因擬南芥植株中高效表達(dá);通過(guò)對(duì)mul-miRn8、mul-miRn26和mul-miRn33成熟體的熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，高效表達(dá)的3個(gè)mul-miRNAs基因均能夠在轉(zhuǎn)基因擬南芥中加工形成成熟體。
　　(3)桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的新miRNAs的生物學(xué)功能分析
　　

5、為了研究桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的3個(gè)新miRNAs的生物學(xué)功能，我們對(duì)轉(zhuǎn)MulMIRn8、MulMIRn26和Mul MIRn3基因擬南芥分別進(jìn)行了非生物脅迫（干旱和鹽脅迫）和生物脅迫（丁香假單胞桿菌番茄致病變種Pseudomonas syringae pv.tomato DC3000，Pst DC3000侵染）處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn):與野生型植株相比，轉(zhuǎn)MulMIRn8擬南芥具有較強(qiáng)的抗Pst DC3000侵染能力和抗干旱脅迫的能力，但抗鹽能力與

6、野生型植株無(wú)明顯差別;與野生型植株相比，轉(zhuǎn)MulMIRn26擬南芥對(duì)于干旱脅迫和Pst DC3000侵染均表現(xiàn)出一定的抗性，但對(duì)鹽脅迫敏感;轉(zhuǎn)MulMIRn3擬南芥雖然具有較強(qiáng)的抗干旱脅迫、鹽脅迫能力，但對(duì)Pst DC3000侵染卻表現(xiàn)為較敏感。因此，桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的3個(gè)新miRNAs在植物響應(yīng)逆境脅迫過(guò)程中均具有一定作用，但其生物學(xué)功能具有明顯差別。
　　(4)桑樹(shù)新miRNAs靶基因的生物學(xué)功能分析
　　為了進(jìn)一步研

7、究桑樹(shù)響應(yīng)植原體侵染的3個(gè)新miRNAs的作用機(jī)制，我們利用生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)3個(gè)miRNAs的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)mul-miRn8的靶基因MulBAH1是一種BAH結(jié)構(gòu)域蛋白;mul-miRn26的靶基因MulZF1是一種含CCCH結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白;mul-miRn33的靶基因MulDME1是一種轉(zhuǎn)錄激活因子(DEMETER)。利用Northern雜交分析，發(fā)現(xiàn)桑樹(shù)新miRNAs在轉(zhuǎn)基因擬南芥中成功表達(dá)后可以通過(guò)靶向擬南芥中的靶基因來(lái)

8、發(fā)揮其基因沉默功能。
　　根據(jù)已有的桑樹(shù)轉(zhuǎn)錄組序列信息，通過(guò)PCR技術(shù)克隆得到MulBAH1和MulZF1基因，構(gòu)建了其植物表達(dá)載體，并成功轉(zhuǎn)化了擬南芥，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。對(duì)轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株進(jìn)行干旱、鹽脅迫和Pst DC3000侵染處理，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MulBAH1擬南芥植株具有較強(qiáng)的抗鹽脅迫的能力，但對(duì)干旱脅迫和病原菌的侵染較敏感;而轉(zhuǎn)MulZF1擬南芥植株對(duì)于鹽脅迫、干旱脅迫和Pst DC3000的侵染均有較強(qiáng)的抗性。因此，響應(yīng)