多點穿刺灌流法分離成人肝細胞及其體外功能的實驗研究.pdf

1、人工肝支持系統(tǒng)是目前公認治療各種急性肝功能衰竭的最有效方法，以肝細胞為基礎(chǔ)的生物型人工肝（Bioartificial Liver，BAL）更是未來治療各種急慢性肝病的希望所在。生物型人工肝以體外培養(yǎng)的具有生物活性的肝細胞為主要構(gòu)成，因而具有類似肝的解毒、分泌、合成及轉(zhuǎn)化等功能，其核心部分便是執(zhí)行肝功能的肝細胞。 隨著近代細胞工程學的進展，細胞生物學、組織培養(yǎng)技術(shù)、生物學技術(shù)的迅猛發(fā)展，肝細胞作為構(gòu)建生物人工肝的生物部分，作為細胞

2、移植治療急慢性肝衰竭的種子細胞以及作為藥物篩選的靶細胞，成為目前研究的熱點。而制備和培養(yǎng)高活力的肝細胞，尤其是人肝細胞的制備，正是這些研究的最基本環(huán)節(jié)。 肝細胞分離方法有多種：機械分離法、鰲合法和酶消化法等。最初的機械分離法始于半個多世紀前，1956年Sorrentino第一次用機械的方法分離新鮮肝組織制成勻漿，并在體外進行藥物解毒試驗，但機械分離法獲得的肝細胞，細胞數(shù)量少、活性差，逐漸被棄用。1967年Howard創(chuàng)建了膠原酶

3、灌流法，1972年Seglen進一步將這種方法發(fā)展為兩步灌流法，即首先灌注預(yù)熱的無鈣平衡鹽溶液去除肝血竇內(nèi)的血細胞及部分非實質(zhì)細胞，然后再灌注含有膠原酶的平衡鹽溶液，進行體外消化后，分離提純而獲得肝細胞。用此法獲得的肝細胞，細胞數(shù)量和活性都得到了提高，而且減少了肝細胞懸液中的雜質(zhì)。膠原酶二步灌流法已成為目前實驗室分離肝細胞的常用方法。 二步灌流法廣泛應(yīng)用于中小型動物如小鼠、大鼠、兔和犬等動物肝臟的分離。目前，人肝細胞的分離也主要

4、應(yīng)用肝移植手術(shù)中因配型不合而丟棄的供肝進行膠原酶二步灌流分離，但此方法的明顯不足在于肝移植的供肝極為緊張，而因配型不合丟棄的供肝更是稀缺，完全無法滿足基礎(chǔ)研究中對人肝細胞的巨大需求，以至于大量的基礎(chǔ)研究不得不用動物的肝細胞來代替人的肝細胞。也有很多學者應(yīng)用肝葉切除的小塊肝組織，通過其殘存的肝臟小血管進行二步法灌流分離肝細胞，但此方法對用于分離肝細胞的肝組織塊要求較高，必須具備有3～4支可供灌流的血管，但實際在手術(shù)中獲取的人肝組織塊大多極

5、不規(guī)則，很難找到血管，因而無法實施二步法灌流。而且即使找到血管，通過殘存的不規(guī)則血管進行灌流，灌流非常不充分，進而影響分離效果。因此，建立實用的從人肝臟分離肝細胞的細胞分離技術(shù)成為很多研究的必需。 本研究在經(jīng)典二步灌流法的基礎(chǔ)上，建立針對手術(shù)切除不規(guī)則小塊肝組織的多點穿刺兩步灌流分離成人肝細胞的新方法，使基礎(chǔ)研究中急需的人肝細胞的獲取更為簡便、容易，從而為應(yīng)用人肝細胞進行生物人工肝、細胞移植等研究提供技術(shù)保障。 本實驗進

6、一步對多點穿刺灌流法分離獲得的原代人肝實質(zhì)細胞進行體外短期培養(yǎng)，并間隔連續(xù)檢測培養(yǎng)細胞上清白蛋白、尿素氮、細胞內(nèi)酶的水平，還檢測了培養(yǎng)細胞的代謝功能。從而，一方面，對多點穿刺灌流法能否分離獲得具有功能活性的肝細胞進行了鑒定，另一方面，對成人原代肝細胞在體外的培養(yǎng)過程中，其功能活性狀況的動態(tài)變化進行了分析。 方法： 1.人肝組織標本來源于南方醫(yī)院肝膽外科肝癌、肝血管瘤患者手術(shù)切除病變的周圍正常組織，約0.5～5g。

7、 2.采用本課題組建立的多點穿刺灌流法分離成人肝細胞。 具體肝細胞分離步驟包括：①應(yīng)用針頭注射器多點穿刺灌注預(yù)熱的38℃灌流液，使肝組織塊由暗紅色變?yōu)榛野咨伊鞒龅墓嗔饕鹤兦辶?，灌注時壓力、流速要恒定，不能有氣泡。此過程大約10-15分鐘。②繼以38℃預(yù)溫的Ⅳ型膠原酶溶液針頭多點穿刺灌注，直至組織塊變疏松、失去彈性，表面呈龜背狀，Ⅳ型膠原酶溶液可循環(huán)使用。此過程大約需15-20分鐘。⑨用無菌眼科剪刀剪開肝組織，并去除殘存的包膜和

8、纖維結(jié)締組織，放入無菌瓶中，繼續(xù)在膠原酶液中37℃震蕩消化15分鐘。④用粗口吸管將消化物吹打為細胞懸液，在冰浴條件下，100目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，收集肝細胞懸液，移至離心管中。⑤4℃下，50g離心5分鐘，去上清，底層沉淀加入紅細胞裂解液室溫靜置3分鐘后，繼續(xù)50g×5分鐘，離心1次。⑥收集底層沉淀，用含DnaseⅠ的肝細胞洗滌緩沖液重懸細胞，再用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾。⑦4℃下，50g離心5分鐘，去上清，無血清DMEM培養(yǎng)基重懸細胞，再次離

9、心，棄上清，沉淀細胞置冰浴中備用。 3.收集的肝細胞，臺盼藍染色，計算肝細胞的活率和得率。用含15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)肝細胞，計算肝細胞24小時貼壁率。 4.用倒置相差生物顯微鏡及全自動顯微攝影裝置對新鮮分離以及原代培養(yǎng)的肝細胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)進行觀察。 5.繪制多點穿刺灌注法分離獲得的原代成人肝細胞的生長曲線。 6.留取多點穿刺灌注法分離的原代人肝細胞培養(yǎng)1天、3天、5天、7天、9天后的上清液，

10、用全自動生化分析儀測定細胞培養(yǎng)上清中尿素（BUN）、堿性磷酸酶（ALP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甲胎蛋白（AFP）的濃度。 7.ELISA法檢測多點穿刺灌注法分離的原代成人肝細胞培養(yǎng)上清中白蛋白的含量。 8.RT-PCR檢測原代培養(yǎng)的人肝細胞的AlbmRNA和細胞色素P4502E1mRNA的表達。 9.安定轉(zhuǎn)化試驗檢測原代培養(yǎng)的人肝細胞代謝功能。 結(jié)果： 1.采用本課題組建立

11、的多點穿刺灌流法分離成人小塊不規(guī)則手術(shù)切除肝組織的肝細胞，肝細胞的活率是87%±7%，分離得到的肝細胞總數(shù)為（2.2±0.7）×107/克肝組織，肝細胞貼壁率為75%左右，且鏡下觀察細胞碎片和其它非實質(zhì)細胞污染相對較少。此外，本方法還對原代肝臟腫瘤細胞的分離培養(yǎng)具有良好效果，分離成功率幾乎達100%。 2.全自動生化分析儀間隔連續(xù)檢測原代成人肝細胞培養(yǎng)上清中生化指標顯示ALT和AST的水平都隨著培養(yǎng)天數(shù)的增加而升高，而ALP無明

12、顯變化趨勢，AFP始終沒有檢測到，BUN的含量在短期體外培養(yǎng)中相對保持在一個高水平上。 3.ELISA法檢測培養(yǎng)的成人肝細胞體外白蛋白分泌量在第三天達到最高峰，以后逐漸下降。原代人肝細胞培養(yǎng)第1天至第7天后細胞上清液中白蛋白的濃度分別是48.2±4.5 ng/ml、55.2±6.9 ng/ml、63.3±6.4 ng/ml、37.0±10.6 ng/ml、22.5±4.9 ng/ml、14.9±5.3、10.0±2.9ng/ml

13、。 4.RT-PCR可以檢測到多點穿刺灌流法獲得的成人原代肝細胞中Alb mRNA和細胞色素P4502E1 mRNA的表達，分別在374bp和338bp處出現(xiàn)明亮條帶。 5.人肝細胞在體外培養(yǎng)的7天內(nèi)均可有效發(fā)揮其對安定的代謝轉(zhuǎn)化作用，其中以體外培養(yǎng)的第3天左右轉(zhuǎn)化能力最強，之后有逐漸下降的趨勢。 結(jié)論： 1.創(chuàng)建了多點穿刺灌流法分離人肝細胞的實驗室操作程序，降低了對肝組織標本的要求，使成人原代肝細胞的獲