促Treg細(xì)胞生成、活化的重組分子pCTL的體外功能驗(yàn)證.pdf

1、目的：FOXP3+CD4+CD25+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)主要在機(jī)體免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮負(fù)向調(diào)節(jié)作用，可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫耐受。然而，機(jī)體內(nèi)此細(xì)胞數(shù)量較少。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)原核表達(dá)獲得促Treg細(xì)胞生成、活化的重組分子pCTL和pC2-C4，并于體外驗(yàn)證兩蛋白誘導(dǎo)Treg細(xì)胞生成及活化的功能。
　　 方法：1．重組蛋白pCTL及pC2-C4的表達(dá)、純化及復(fù)性：將構(gòu)建正確的重組質(zhì)粒pET28a-C2-C4-L- hmTGF-βi及pET2

2、8a-C2-C4轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)，使用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，超聲破碎細(xì)菌，包涵體洗滌及鎳親和層析法純化目的蛋白，透析復(fù)性方式復(fù)性純化后蛋白；復(fù)性后重組蛋白pCTL與人舌鱗癌細(xì)胞Tca8113共培養(yǎng)以驗(yàn)證蛋白活性。2．重組蛋白pCTL體外促Na(i)ve T細(xì)胞Treg化的作用分析：將pCTL作用于新鮮分離純化的人外周血淋巴細(xì)胞，以流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)作用后CD4+CD25+T細(xì)胞的比率的變化；pCTL與CD3單抗(OK

3、T3)共刺激淋巴細(xì)胞，使用熒光定量PCR及Western blot方法分別檢測(cè)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3mRNA及FOXP3蛋白的表達(dá)情況；同時(shí)以MTT方法檢測(cè)不同時(shí)間、不同濃度的pCTL對(duì)淋巴細(xì)胞細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用。3．重組蛋白pC2-C4體外作用初探：復(fù)性后pC2-C4蛋白與OKT3共培養(yǎng)，以MTT方法檢測(cè)不同時(shí)間、不同濃度的pC2-C4對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制作用；同時(shí)以熒光定量PCR及Westem blot方法分別

4、檢測(cè)Treg細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子FOXP3 mRNA及FOXP3蛋白的表達(dá)情況。
　　 結(jié)果：1．成功獲得以包涵體形式表達(dá)的重組蛋白pCTL及pC2-C4，經(jīng)純化后蛋白純度＞95％，復(fù)性后重組蛋白pCTL可以抑制Tca8113細(xì)胞的增殖。2．重組蛋白作用于淋巴細(xì)胞后CD4+CD25+Treg細(xì)胞的比例較對(duì)照組增高；FOXP3 mRNA及FOXP3蛋白的表達(dá)量均增高；pCTL可抑制淋巴細(xì)胞的增殖，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)及蛋白濃度的降低對(duì)細(xì)胞

5、增殖的抑制作用減輕。3．重組蛋白pC2-C4可與CD4+T淋巴細(xì)胞特異性結(jié)合；抑制淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)；并且可增加活化后淋巴細(xì)胞的FOXP3 mRNA及FOXP3蛋白的表達(dá)量。pC2-C4與pTGF-β1共作用，可抑制淋巴細(xì)胞的增殖，作用強(qiáng)度與pCTL無(wú)明顯差異；pC2-C4與TGF-β1蛋白作用的先后順序不同，對(duì)淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的抑制情況不同，TGF-β1作用在先時(shí)抑制作用較強(qiáng)。
　　 結(jié)論：1．成功獲得高純度的有活性的重組蛋白p