成人原代肝細(xì)胞的分離、鑒定及其蛋白質(zhì)合成與P450表達(dá).pdf

1、目的:探討手術(shù)切除的成人良性病變肝葉的肝細(xì)胞分離及細(xì)胞鑒定技術(shù)，研究成人原代肝細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞活力的改變，及蛋白質(zhì)合成與細(xì)胞色素P450表達(dá)的變化。
　　方法:選擇肝臟良性病變的手術(shù)切除肝葉標(biāo)本，采用改良膠原酶灌注分離法分離肝細(xì)胞，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)法對分離后的新鮮肝細(xì)胞計(jì)數(shù)，臺盼藍(lán)拒染法檢測新鮮肝細(xì)胞活率;利用過碘酸-schiff(PAS)反應(yīng)來檢測肝細(xì)胞的糖原合成能力，并利用免疫組織化學(xué)方法來測定肝細(xì)胞角蛋白CK18的表達(dá)聯(lián)

2、合判斷肝細(xì)胞純度;用CCK-8法檢測連續(xù)培養(yǎng)7d肝細(xì)胞的細(xì)胞活力;全自動(dòng)生化分析儀檢測成人原代肝細(xì)胞在培養(yǎng)過程的白蛋白、尿素合成及相關(guān)生化功能指標(biāo);應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法(Western Blot)檢測體外培養(yǎng)肝細(xì)胞細(xì)胞色素P450表達(dá)（生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)第一相反應(yīng)）。
　　結(jié)果:
　　1.新鮮分離的成人原代肝細(xì)胞數(shù)目大于109個(gè)，臺盼藍(lán)拒染法檢測肝細(xì)胞活率達(dá)90％或以上。
　　2.培養(yǎng)24小時(shí)后，肝細(xì)胞PAS糖原染色發(fā)現(xiàn)成人原代

3、肝細(xì)胞內(nèi)糖原被染成紅色顆粒或片狀，抗細(xì)胞角蛋白CK-18免疫組織化學(xué)染色發(fā)現(xiàn)CK-18在肝細(xì)胞內(nèi)均勻分布，被染成棕黃色;糖原染色及細(xì)胞角蛋白CK-18聯(lián)合鑒定肝細(xì)胞純度達(dá)95％以上。
　　3.CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示肝細(xì)胞培養(yǎng)第三天細(xì)胞活力處于最佳狀態(tài)。
　　4.培養(yǎng)的1周的過程中，肝細(xì)胞均具有良好的合成糖原、白蛋白和尿素的功能。
　　5.培養(yǎng)過程中，ALT、AST、LDH的泄漏率呈下降后上升的趨勢，在培養(yǎng)3天時(shí)達(dá)到最低

4、，培養(yǎng)4天時(shí)開始上升，白蛋白的分泌量和尿素合成量在培養(yǎng)3天時(shí)達(dá)到最高，培養(yǎng)4天時(shí)開始下降。
　　6.在離體培養(yǎng)1-7天中，肝細(xì)胞在80KD處均可見有細(xì)胞色素P450表達(dá)，并且在第3天表達(dá)最好。
　　結(jié)論:
　　1.改良膠原酶灌注分離法分離肝細(xì)胞操作步驟簡單，得到的肝細(xì)胞數(shù)目多、純度高且具有完善的細(xì)胞功能。
　　2.本研究所示肝細(xì)胞的細(xì)胞活力及細(xì)胞的生化性質(zhì)均在培養(yǎng)的第3天時(shí)達(dá)到最好的狀態(tài)。
　　3.在離體培