非對(duì)稱二甲基精氨酸促動(dòng)脈粥樣硬化形成及（口山）酮治療研究.pdf

1、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)是一種發(fā)生在大動(dòng)脈上的慢性炎癥，是冠心病和中風(fēng)等疾病發(fā)生的主要原因。眾所周知血管內(nèi)皮功能紊亂被認(rèn)為是AS形成的始動(dòng)環(huán)節(jié)。由血管內(nèi)皮細(xì)胞一氧化氮合酶(NOS)催化L-精氨酸生成的一氧化氮(NO)在調(diào)節(jié)內(nèi)皮功能中發(fā)揮重要作用。內(nèi)源性NOS抑制物非對(duì)稱二甲基精氨酸(ADMA)與內(nèi)皮功能紊亂的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。ADMA除了抑制NO的合成，還能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，參與炎性反應(yīng)，促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。 氧化應(yīng)激可通過(guò)降低NO的生

2、物利用度而引起內(nèi)皮功能紊亂，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展。氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)誘導(dǎo)氧化應(yīng)激促進(jìn)內(nèi)皮功能紊亂，也能誘導(dǎo)ADMA的生成；多種具有抗氧化作用的藥物可通過(guò)降低ADMA濃度來(lái)改善血管內(nèi)皮功能。 骨橋蛋白(OPN)是一種促炎癥因子，OPN及其受體粘附分子CD44在AS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起重要作用。AS患者血漿OPN的濃度顯著升高，糖尿病、高血壓、高膽固醇血癥、細(xì)胞因子等致AS的危險(xiǎn)因素均可升高OPN的水平。OPN參與

3、炎癥反應(yīng)，損傷內(nèi)皮細(xì)胞、促血管平滑肌細(xì)胞增殖，從而促進(jìn)AS的發(fā)生與發(fā)展。 口山酮是普遍存在于植物中的一類多酚類化合物。實(shí)驗(yàn)室以前的工作證明口山酮單體能降低ADMA水平，減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。 最近研究證明，ADMA也參與炎癥反應(yīng)，但其機(jī)制尚未明了。有文獻(xiàn)報(bào)道NOS的抑制劑左旋硝基精氨酸(L-NNA)能上調(diào)OPN的表達(dá)，抗氧化劑能抑制OPN表達(dá)的上調(diào)。因此推測(cè)ADMA可通過(guò)上調(diào)OPN的表達(dá)，促進(jìn)血管炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展。本研

4、究在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和培養(yǎng)細(xì)胞，探討了ADMA促AS形成與OPN途徑的關(guān)系；在此基礎(chǔ)上，研究3，4，5，6-四羥基口山酮的抗AS作用及機(jī)制。 研究背景:NO生物利用度降低所引起的內(nèi)皮功能紊亂是AS形成早期的重要事件。近年大量的研究表明，內(nèi)源性NOS抑制物ADMA與AS密切相關(guān)。ADMA除了抑制NOS活性阻止NO合成，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞與平滑肌細(xì)胞凋亡等作用外，還可參與炎癥反應(yīng)，其機(jī)制尚未明了。 OPN是一種促炎癥細(xì)胞因子

5、。OPN及其受體一粘附分子CD44，與AS形成密切相關(guān)。研究表明，AS患者血漿中OPN的水平明顯升高；OPN缺失小鼠AS形成減緩。文獻(xiàn)報(bào)道，NOS的抑制劑L-NNA能上調(diào)OPN表達(dá)。因此，推測(cè)ADMA引起炎性反應(yīng)可能涉及OPN-CD44途徑。 ApoE基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是研究AS常用的動(dòng)物模型。研究報(bào)道，ApoE-/-小鼠內(nèi)源性ADMA水平顯著升高。目前缺乏ADMA的抑制劑以確證其促AS作用，因此，本實(shí)驗(yàn)在ApoE-

6、/-小鼠，研究了內(nèi)、外源性ADMlA促AS形成及其機(jī)制。文獻(xiàn)報(bào)道，ox-LDL及其主要成分溶血性磷脂酰膽堿(LPC)均能誘導(dǎo)ADMA的生成，損傷內(nèi)皮細(xì)胞。在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞，進(jìn)一步觀察內(nèi)、外源性ADMA對(duì)OPN及其受體CD44表達(dá)的影響。 方法: 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)分設(shè)4組(n=10)：野生型C57BL/6J小鼠組(C57BL/6J)；野生型C57BL/6J小鼠加外源性ADMA處理組(C57BL/6J+ADMA)；

7、ApoE基因缺陷小鼠組(ApoE-/-組)；ApoE基因缺陷小鼠加外源性ADMA處理組(ApoE-/-+ADMA組)。ADMA處理組每日皮下(S.C.)注射ADMA5mg/kg，共4周，其他組每日S.C.注射等量生理鹽水。4周后，頸動(dòng)脈取血，離心分離血漿，檢測(cè)血漿ADMA(HPLC法)濃度；開(kāi)胸，迅速分離主動(dòng)脈，觀察動(dòng)脈粥樣損傷(蘇丹紅染色法)及主動(dòng)脈內(nèi)皮OPNmRNA和蛋白表達(dá)(RT-PCR法和免疫組化法)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)

8、 (1)LPC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)分為：空白對(duì)照組，用DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h；不同濃度LPC處理組，加入終濃度分別為1，3，10μg/ml的LPC孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h。檢測(cè)內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)液中OPN(ELISA法)和ADMA(HPLC法)濃度，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS水平(熒光法)，內(nèi)皮細(xì)胞OPNmRNA(RT-PCR法)，OPN蛋白(Western-blot法)和粘附分子CD44mRNA(RT-PCR法)

9、表達(dá)。 (2)ADMA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響量效實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，用DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h；不同濃度ADMA處理組，加入終濃度分別為0.3，1，3，10，30μM的ADMA孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h，選擇ADMA的最佳劑量；時(shí)效實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組，用DMEM培養(yǎng)液孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h；加入終濃度為30μM的ADMA分別處理內(nèi)皮細(xì)胞12h，24h，48h，選擇ADMA的最佳處理時(shí)間。檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液OPN濃度(ELISA法)及內(nèi)皮細(xì)

10、胞OPNmRNA和蛋白(分別用RT-PCR法和Western-blot法)和粘附分子CD44mRNA(RT-PCR法)表達(dá)。 結(jié)果: 1.動(dòng)物實(shí)驗(yàn) ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊明顯，同時(shí)伴有血漿ADMA水平升高；給予外源性ADMA(5mg/kg，4w)可進(jìn)一步升高ApoE-/-小鼠及C57BL/6J小鼠血漿ADMA水平，同時(shí)顯著增加ApoE-/-小鼠動(dòng)脈粥樣斑塊面積及促進(jìn)C57BL/6J小鼠動(dòng)脈粥樣損傷的形成；

11、ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮OPNmRNA和蛋白表達(dá)顯著升高；同時(shí)，外源性ADMA可以顯著上調(diào)C57BL/6J小鼠和ApoE-/-小鼠主動(dòng)脈內(nèi)皮OPNmRNA和蛋白表達(dá)。 2.細(xì)胞實(shí)驗(yàn) (1)LPC對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響10μg/mLLPC孵育內(nèi)皮細(xì)胞24h，可顯著升高ROS，OPN及ADMA水平；上調(diào)OPNmRNA，OPN蛋白和CD44mRNA表達(dá)。 (2)ADMA對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的影響30μM ADMA在培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞2