非對(duì)稱性二甲基精氨酸在大鼠主動(dòng)脈粥樣硬化中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景和目的：
　　 動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis，As)是心血管疾病的早期病理過程，從As產(chǎn)生到出現(xiàn)臨床癥狀要經(jīng)過數(shù)十年的發(fā)展，在此漫長(zhǎng)的過程中，人們往往忽略危險(xiǎn)的存在，又因傳統(tǒng)的防治措施作用有限，使As的發(fā)展難以遏制。減緩乃至逆轉(zhuǎn)As的發(fā)生發(fā)展是防治心血管疾病，提高人們生活質(zhì)量的客觀要求，因此，明確As發(fā)生發(fā)展機(jī)制，尋找早期有效的防治As的靶點(diǎn)十分必要。通過從基因水平、細(xì)胞水平和整體水平對(duì)As廣泛而深入的研

2、究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞 (Smooth musle cells，SMCs)是構(gòu)成粥樣斑塊的主要細(xì)胞成分，血管內(nèi)皮功能失調(diào)、SMCs增殖和脂質(zhì)沉積是粥樣斑塊形成的三個(gè)重要環(huán)節(jié)，巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞是其中的關(guān)鍵步驟。但是，這一系列過程的詳細(xì)機(jī)制仍不十分清楚。目前有關(guān)As的研究較多集中在血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷和SMCs增殖，對(duì)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞的機(jī)制及其調(diào)控研究較少，國(guó)內(nèi)少見報(bào)道。近年研究發(fā)現(xiàn)，非對(duì)稱性二甲基精氨酸 (Asym

3、metric dimethylarginine，ADMA)血漿水平在冠心病、高血壓、高血脂、糖尿病、高同型半胱氨酸血癥、胰島素抵抗、心力衰竭、腎功能衰竭時(shí)明顯升高，其作用及機(jī)制成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。ADMA是內(nèi)源性一氧化氮合酶 (Nitric oxide synthase，NOS)的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，可致內(nèi)皮功能受損、SMCs增生，在巨噬細(xì)胞泡沫化中的作用尚不清楚。NOS分為神經(jīng)型(Neural nitric oxide synthase，n

4、NOS)、內(nèi)皮型(Endothelial oxide synthase，eNOS)和誘導(dǎo)型(Inducible oxide synthase，iNOS)三種。nNOS和eNOS是機(jī)體正常存在的，大多數(shù)學(xué)者認(rèn)為iNOS在正常情況下幾乎不表達(dá)，當(dāng)細(xì)胞受到炎癥因子、免疫因子等刺激時(shí)表達(dá)增加。氧化型低密度脂蛋白 (Oxidized low density lipoprotein，oxLDL)對(duì)粥樣硬化形成過程中泡沫細(xì)胞聚集有重要作用，細(xì)胞攝取o

5、xLDL由數(shù)種清道夫受體介導(dǎo)，血凝素樣低密度脂蛋白受體-1 (Lectin-like low density lipoprotein recepter-1，LOX-1)是其中最特異的oxLDL受體。LOX-1主要在人冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、牛主動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞、兔和大鼠主動(dòng)脈表達(dá)，在巨噬細(xì)胞、血小板和SMCs也有少量表達(dá)。研究表明，ADMA可上調(diào)血管內(nèi)皮細(xì)胞、SMCs和巨噬細(xì)胞株NR8383 LOX-1表達(dá)，提示ADMA與As可能密切相關(guān)。本研究

6、擬采用分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，用ADMA干預(yù)oxLDL預(yù)處理的原代培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞，觀察巨噬細(xì)胞iNOS和LOX-1表達(dá)，以探討ADMA對(duì)巨噬細(xì)胞泡沫化的影響及機(jī)制；給高脂飼養(yǎng)的大鼠ADMA后，檢測(cè)大鼠主動(dòng)脈脂質(zhì)沉積及iNOS和LOX-1表達(dá)，以期對(duì)ADMA在大鼠粥樣硬化中的作用及機(jī)制進(jìn)行初步探討，為ADMA成為心血管疾病防治靶點(diǎn)提供可能的理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 Wistar

7、大鼠42只。分離培養(yǎng)大鼠腹腔巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分組及處理：① 對(duì)照組：巨噬細(xì)胞與 PBS (PH6.8)孵育48h。② oxLDL組：巨噬細(xì)胞與oxLDL(終濃度50μg/mL)共育48h。③ 0+A組：先以oxLDL(終濃度50μg/mL)與巨噬細(xì)胞共育24h，再加入ADMA(終濃度15μmol/L)繼續(xù)孵育24h。 ④ 0+A+L組：先以oxLDL(終濃度50μg/mL)與巨噬細(xì)胞共育24h，再加入ADMA(終濃度15μmol/L)和L

8、-Arg(終濃度1.2mmol/L)繼續(xù)孵育24h。收集細(xì)胞和培養(yǎng)液，測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量及培養(yǎng)液NO水平和iNOS活性，提取細(xì)胞總RNA和總蛋白，分別通過半定量RT-PCR和Western-blot檢測(cè)巨噬細(xì)胞iNOS，LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。每組重復(fù)3次。
　　 2.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 Wistar大鼠48只，隨機(jī)分為四組：① 正常對(duì)照組(n=8)：標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料，正常飲水

9、。② 高脂組(n=12)：高脂飼料，正常飲水。③ ADMA組(n=14)：高脂飼料，正常飲水，ADMA (0.2mg/Kg/d)灌胃，每日一次。④ ADMA+L-Arg組(n=14)：高脂飼料，飲水中含3[％] L-Arg，ADMA(0.2mg/Kg/d)灌胃，每日一次。飼養(yǎng)滿18周后取血，測(cè)定大鼠血清總膽固醇、甘油三酯、NO及iNOS水平，取胸主動(dòng)脈做病理切片，觀察其病理變化。以半定量RT-PCR和Western-blot分別檢測(cè)主動(dòng)

10、脈iNOS和LOX-1 mRNA及蛋白表達(dá)，以β-actin為內(nèi)參照進(jìn)行標(biāo)化。
　　 結(jié)果：
　　 1.體外細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)：
　　 ① oxLDL組和O+A組巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量較正常對(duì)照組明顯增加(均p<0.01)，且O+A組較oxLDL組升高更明顯(p<0.05)，而O+A+L組膽固醇含量較O+A組降低(p<0.05)。 ②與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，0+A組NO含量降低(p<0.01或p<0.05)；0+A

11、+L組NO含量較0+A組顯著升高(p<0.05)。③與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，0+A組iNOS活力明顯升高(均p<0.05)，0+A+L組iNOS活力較0+A組降低(p<0.05)。雙變量相關(guān)性分析顯示，NO含量與iNOS活力呈負(fù)相關(guān) (r=-0.697，p=0.012)。④與正常對(duì)照組和oxLDL組相比，O+A組iNOS mRNA和蛋白表達(dá)量顯著增加，其差異均有顯著性(均p<0.01)；O+A+L組iNOS mRNA和蛋白表達(dá)較

12、O+A組降低(均P<0.01)。 ⑤ O+A組LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)較正常對(duì)照組和oxLDL組增強(qiáng)，其差異均有顯著性(均p<0.05)；與O+A組相比，O+A+L組LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)降低，兩組差異有顯著性(p<0.001或 p<0.05)。
　　 2.動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：
　　 ① 主動(dòng)脈病理切片顯示正常對(duì)照組血管內(nèi)膜光滑、完整，無脂質(zhì)沉積；高脂組血管內(nèi)膜光滑、完整，有少量脂質(zhì)沉積；ADMA組血管內(nèi)膜斷裂，

13、內(nèi)膜下有明顯脂質(zhì)沉積，血管中層SMCs增生明顯，且排列紊亂；ADMA+L-Arg組血管內(nèi)膜完整，脂質(zhì)沉積和SMCs增生較ADMA組減弱。② ADMA組大鼠血清NO水平和iNOS活性明顯升高，與正常對(duì)照組和高脂組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異 (p<0.01或 p<0.05)，ADMA+L-Arg組NO水平和iNOS活性較ADMA組明顯下降 (均p<0.05)。雙變量相關(guān)性分析顯示，NO與iNOS間呈正相關(guān) (r=0.512，p=0.003)。③ 高脂

14、組、ADMA組和ADMA+L-Arg組血清TG和TC水平均升高，與正常對(duì)照組相比有顯著性差異(均p<0.01)。 ④ ADMA組大鼠主動(dòng)脈iNOS mRNA和蛋白表達(dá)量與正常對(duì)照組和高脂組相比顯著上調(diào)(p<0.001或p<0.05)；ADMA+L-Arg組iNOS mRNA和蛋白表達(dá)量較ADMA組明顯降低(均p<0.01)。⑤ ADMA組大鼠主動(dòng)脈LOX-1 mRNA和蛋白表達(dá)量較正常對(duì)照組和高脂組顯著上調(diào)(p<0.01或p<0.001