Runx1在腦死亡供體肝臟中作用機制研究.pdf

1、第一章兔腦死亡肝臟差異蛋白表達趨勢檢測
　　目的：根據(jù)前期蛋白質(zhì)組學技術篩選出的顯著性差異蛋白Runx1，研究其在腦死亡肝臟中表達趨勢變化。
　　方法：使用免疫組化、PCR、western blot在轉(zhuǎn)錄翻譯水平驗證Runx1蛋白在腦死亡肝臟中表達水平變化。
　　結(jié)果：免疫組化、RT-PCR、Western blot檢測腦死亡后Runx1蛋白在肝臟中表達水平變化，發(fā)現(xiàn)隨著腦死亡持續(xù)時間延長，Runx1蛋白呈下降趨勢，在

2、8小時時間點表達水平最低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：緩慢間斷顱內(nèi)加壓法腦死亡后肝臟采用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜分析，鑒定出Runx1蛋白表達水平在腦死亡前后肝臟細胞中有顯著變化，該蛋白定位于細胞核內(nèi)，是細胞增殖與分化相關蛋白質(zhì)，隨著腦死亡時間的延長，在肝臟中的表達逐漸減少，可能參與致肝臟損傷過程。
　　第二章 Runx1蛋白對缺血缺氧肝臟細胞作用的體外實驗研究
　　目的：體外細胞實驗探索Runx1蛋白對缺血缺氧肝臟細胞的作

3、用。
　　方法：使用質(zhì)粒為載體的全長度Runx1 eDNA pEGFP-N1-RUNX1轉(zhuǎn)染大鼠肝臟，使Runx1基因過表達;轉(zhuǎn)染pEGFP-N1為陰性對照組，對質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后的大鼠肝臟細胞進行缺血缺氧處理;實驗分為四組:對照組（C組）、缺血缺氧組(IS)、轉(zhuǎn)染陰性對照+缺血缺氧組(S+IS)、Runx1過表達+缺血缺氧組(OS+IS)。流式細胞儀檢測各組大鼠肝臟的細胞凋亡率，檢測TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表

4、達水平，研究Runx1蛋白對缺血缺氧細胞肝臟作用機制。
　　結(jié)果：pEGFP-N1-RUNX1轉(zhuǎn)染大鼠肝臟細胞48小時后Rux1蛋白表達水平達到峰值。PCR和Western blot檢測Runx1表達水平在IS組和S+IS組較對照組明顯降低(P＜0.05)，在OS+IS組較對照組表達明顯升高(P＜0.01)。流式細胞儀檢測各組細胞凋亡率，IS組和S+IS組較對照組細胞凋亡明顯升高(P＜0.01)，OS+IS組細胞凋亡率較IS組和S

5、+IS組明顯降低(P＜0.05)。PCR檢測大鼠肝臟細胞各組TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達水平。在IS組、S+IS組、OS+IS組中，TGF-β mRNA表達水平全部升高(P＜0.05)，三組之間沒有明顯差異(P＞0.05)。在IS組和S+IS組中，Bcl-2 mRNA與C組相比表達水平顯著降低(P＜0.05)，但兩組間沒有統(tǒng)計學差異(P＞0.05)，Bim、TNF-α表達水平顯著升高(P＜0.05);在OS+

6、IS組中Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高(P＜0.05)，Bim、TNF-α mRNA表達水平明顯降低(P＜0.05)。Runx1表達水平的改變引起了Bcl-2/Bim、TNF-α mRNA表達水平的顯著改變，因此Bcl-2/Bim、TNF-α是受到Runx1蛋白調(diào)控的下游信號分子。
　　結(jié)論：體外細胞實驗證實，肝臟細胞在缺血缺氧后，Runx1明顯降低，TGF-β、Bim、TNF-α等細胞凋亡相關因子明顯升高;采用pEGFP-

7、N1-RUNX1真核載體轉(zhuǎn)染方法可有效的使Runx1在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平表達增加。過表達Runx1后，TGF-β表達含量無明顯變化，而Bcl-2、Bim、TNF-α等凋亡相關因子表達顯著變化;過表達Runx1后細胞凋亡率顯著降低，這與Runx1誘導凋亡抑制因子Bcl-2升高并使得促凋亡因子Bim、TNF-α表達降低有關。Runx1是通過調(diào)控Bcl-2/Bim家族表達，經(jīng)線粒體凋亡途徑誘導細胞凋亡;同時，Runx1促進TNF-α表達，通過細胞

8、外凋亡途徑引起細胞凋亡;
　　第三章 Runx1蛋白對腦死亡大鼠肝臟細胞作用機制的在體實驗研究
　　目的：通過腦死亡大鼠在體實驗研究進一步證實TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信號通路對腦死亡肝臟細胞作用機制。
　　方法：高壓注射質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠尾靜脈pEGFP-N1-RUNX1，并實行腦死亡手術。將實驗分為假手術組（C組）、腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對照+腦死亡組(S+BD)、

9、Runx1過表達+腦死亡組(OS+BD)。檢測各組肝臟在2h、4h、6h、8h時間點ALT、AST水平和肝臟形態(tài)學變化，以觀察各組肝臟功能損傷;PCR檢測各組2h、4h、8h時間點Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達水平，驗證Runx1對肝臟作用機制。
　　結(jié)果：高壓注射質(zhì)粒轉(zhuǎn)染大鼠尾靜脈pEGFP-N1-RUNX1在48小時后Runx1表達達到峰值，后逐漸下降。檢測各組ALT、AST水平，與對照組

10、相比，BD組與S+BD組ALT、AST的水平明顯升高(P＜0.05)，但兩組間相差無統(tǒng)計學意義(P＞0.05);OS+BD組在各個時間點血清中ALT、AST水平較BD組與S+BD組降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.01)。肝臟形態(tài)學檢測顯示，與BD組相比，OS+BD組各時間點肝臟細胞損傷程度均減輕。PCR檢測大鼠肝臟細胞假手術組（C組）、腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對照+腦死亡組(S+BD)、Runx1過表達+腦死亡組(OS+BD)中2

11、h、4h、8h時間點Runx1、TGF-β、Bcl-2、Bim、TNF-α mRNA表達水平，GAPDH為參照。在各個時間點，腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對照+腦死亡組(S+BD)、Runx1過表達+腦死亡組(OS+BD)TGF-βmRNA表達水平升高，三組處理方式間無統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在各個時間點與假手術組相比，腦死亡組(BD)、轉(zhuǎn)染陰性對照+腦死亡組(S+BD) Bcl-2 mRNA表達水平降低，Bim、TNF-α表達水平升

12、高(P＜0.05);而Runx1過表達+腦死亡組(OS+BD)，Bcl-2 mRNA表達水平明顯升高，而Bim、TNF-α表達水平降低(P＜0.05)，相對應肝臟形態(tài)學，肝臟細胞壞死凋亡面積減輕，炎癥細胞浸潤減少。
　　結(jié)論：Runx1在體大鼠腦死亡實驗證實，Runx1在腦死亡肝臟中表達含量的降低，引起肝臟細胞凋亡增加;Runx1對肝臟細胞的作用是通過TGF-β-Runx1-Bcl-2/Bim和TGF-β-Runx1-TNF-α信