胰高血糖素樣肽-1介導(dǎo)cAMP-PKA-Rho信號(hào)通路在糖尿病心肌微血管損傷中的保護(hù)作用.pdf

1、實(shí)驗(yàn)背景:
　　糖尿病是危害人類健康的重大疾病,具有高發(fā)病率,高致殘率和高致死率的特點(diǎn)。糖尿病心血管并發(fā)癥是引發(fā)糖尿病患者死亡的首要原因。2007年ESC/EASD(歐洲心臟病學(xué)會(huì)/歐洲糖尿病研究學(xué)會(huì))指南中指出與非糖尿病人群相比,男性糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加了2-3倍,而女性糖尿病患者心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加了3-5倍。另有研究發(fā)現(xiàn),糖尿病患者急性心肌梗死后給予血管再通治療時(shí)無(wú)復(fù)流現(xiàn)象的發(fā)生率是非糖尿病患者的4倍,而急

2、性心肌梗死后充血性心力衰竭的發(fā)生率是非糖尿病患者的3倍。因此,尋找有效的干預(yù)靶點(diǎn)早期防治糖尿病心血管并發(fā)癥對(duì)于糖尿病患者的預(yù)后具有十分重要的意義。
　　糖尿病心肌微血管損傷在糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。心肌微血管位于循環(huán)的末梢部分,決定心肌灌注水平,在一定程度上影響冠脈儲(chǔ)備。在糖尿病狀態(tài)下,心肌微血管損傷早于大血管及心肌細(xì)胞。目前研究已發(fā)現(xiàn)糖尿病患者心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接不完整,屏障功能降低,同時(shí)心肌微血管密

3、度降低,微血管數(shù)/心肌纖維數(shù)比率降低,這些變化導(dǎo)致了心肌微循環(huán)障礙。心肌微循環(huán)是心肌細(xì)胞與血液進(jìn)行物質(zhì)交換的場(chǎng)所,微循環(huán)障礙會(huì)影響微循環(huán)灌注,造成心肌局部或整體氧供與血流量失衡,從而引起心臟的結(jié)構(gòu)變化和功能障礙。即使無(wú)明顯冠脈大血管狹窄,糖尿病心肌微循環(huán)障礙仍可導(dǎo)致臨床不良事件的發(fā)生。因此,減輕糖尿病心肌微血管損傷對(duì)于糖尿病心血管并發(fā)癥的防治非常重要,但是,目前仍無(wú)有效的措施干預(yù)并延緩糖尿病心肌微血管損傷的發(fā)生發(fā)展。
　　胰高血糖

4、素樣肽-1(glucogan like peptide-1,GLP-1)是由空、回腸上皮L細(xì)胞分泌的一種小分子多肽。近年研究發(fā)現(xiàn),GLP-1除了降血糖作用外,對(duì)心血管系統(tǒng)也有直接的保護(hù)作用,如減輕心肌缺血/再灌注損傷、舒張血管、促進(jìn)病理狀態(tài)下心室功能的恢復(fù)等,而抗氧化應(yīng)激損傷是其發(fā)揮心血管保護(hù)作用的重要機(jī)制之一。已有研究指出,氧化應(yīng)激是引起糖尿病和心血管疾病的“共同土壤”,內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激可導(dǎo)致內(nèi)皮功能失調(diào),從而引發(fā)心血管疾病的發(fā)生。但

5、是,GLP-1對(duì)于糖尿病心肌微血管是否具有保護(hù)作用尚未見(jiàn)報(bào)道,其發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制是否是通過(guò)抗氧化應(yīng)激損傷仍需進(jìn)一步的研究。
　　因此,本課題擬分別從整體動(dòng)物、組織和細(xì)胞水平觀察GLP-1對(duì)糖尿病心肌微血管損傷的保護(hù)作用,并進(jìn)一步研究其發(fā)揮保護(hù)作用的下游分子機(jī)制。
　　研究目的:
　　1.建立糖尿病大鼠模型,明確vidgliptin和exenatide對(duì)糖尿病大鼠心肌微血管損傷的保護(hù)作用,并進(jìn)一步明確心肌微血管功能的改

6、善對(duì)心臟葡萄糖攝取能力及心臟功能的影響。
　　2.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,明確心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞是否表達(dá)GLP-1受體,并進(jìn)一步觀察GLP-1對(duì)高糖作用下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用。
　　3.明確 GLP-1發(fā)揮心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的機(jī)制,致力于闡明cAMP/PKA/Rho信號(hào)通路在其中的作用。
　　研究方法:
　　1.選取體重為200-220 g雄性SD大鼠,腹腔注射35 mg/kg鏈脲佐菌素(st

7、reptozocin,STZ),連續(xù)3天,以2次隨機(jī)血糖≥16.7mmol/L視為糖尿病造模成功。
　　2.將糖尿病大鼠隨機(jī)分為6組,分別為:糖尿病+vildagliptin(1mg/kg),糖尿病+exenatide(1nmol/kg),糖尿病+insulin(0.5 U),糖尿病+insulin(1U),糖尿病+insulin(1.5U),糖尿病+insulin(2U),測(cè)各組血糖,連續(xù)監(jiān)測(cè)14天,選擇與vildaglipti

8、n和exenatide降糖能力相當(dāng)?shù)膇nsulin劑量。
　　3.將糖尿病大鼠隨機(jī)分為4組,分別給予vehicle,vildagliptin(1mg/kg),exenatide(1nmol/kg)或insulin(1.5U)治療12周,以正常大鼠作為對(duì)照組,檢測(cè)各組大鼠體重、血糖及胰島素水平的變化。
　　4.以樹脂(Mercox,SPI)灌注各組大鼠心臟,掃描電鏡下觀察心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整性。
　　5.取各組大鼠

9、心臟懸掛于Langendorff裝置,硝酸鑭灌流液以生理壓力灌流20分鐘,透射電鏡下檢測(cè)各組大鼠心肌微血管的屏障功能變化。
　　6.采用小動(dòng)物超聲檢測(cè)各組大鼠心臟功能。
　　7.采用小動(dòng)物PET/CT檢測(cè)各組大鼠心臟葡萄糖攝取能力。
　　8.分離培養(yǎng)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞,分為以下4組:對(duì)照組(5.5mmol/L),高糖組(25mmol/L)+vehicle,GLP-1預(yù)處理組(10nmol/L),高糖+GLP-1預(yù)處理組

10、。
　　9.采用免疫熒光及Western blot法檢測(cè)大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞GLP-1受體的表達(dá)。
　　10.采用超氧化物試劑盒及超氧化物陰離子探針檢測(cè)各組心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 ROS的生成。
　　11.通過(guò)TUNEL法及caspase3表達(dá)測(cè)定心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡。
　　12.采用Western blot法檢測(cè)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞p47phox,gp91phox,p22phox,p40phox, Rho及ROC

11、K的表達(dá)。
　　研究結(jié)果:
　　1.每日給予長(zhǎng)效insulin1.5 U時(shí),其降糖作用與vildagliptin(1mg/kg/d)及exenatide(1nmol/kg/d)的降糖作用相當(dāng)。
　　2.糖尿病大鼠心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接不完整,屏障功能降低,給予小劑量insulin治療其改善不明顯,給予vildagliptin或exenatide治療12周后,其心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞連接完整性及心肌微血管屏障功能明顯改善。<

12、br>　　3.糖尿病大鼠心臟葡萄糖攝取能力明顯降低,給予小劑量insulin治療其葡萄糖攝取能力無(wú)明顯改善,而給予vildagliptin或exenatide治療12周以后,其心臟葡萄糖明顯改善。
　　4.糖尿病大鼠心臟舒張功能明顯降低,給予小劑量insulin治療其心臟舒張功能改善不明顯,而給予vildagliptin或exenatide治療12周后,其心臟舒張功能明顯改善,但是其收縮功能無(wú)顯著變化。
　　5.心肌微血管內(nèi)

13、皮細(xì)胞呈“鋪路石樣”生長(zhǎng),乙酰低密度脂蛋白吞噬實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性。
　　6.免疫熒光及Western blot法檢測(cè)均發(fā)現(xiàn)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)GLP-1受體。
　　7.高糖可誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS生成增加,給予GLP-1預(yù)處理后,ROS生成減少。
　　8.高糖作用下心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 NADPH氧化酶活性升高,p47phox,gp91phox, p22phox及 p40phox表達(dá)增加,給予 GLP-1預(yù)處理后,NADP

14、H氧化酶活性下降, p47phox,gp91phox,p22phox及p40phox表達(dá)降低。
　　9.高糖可誘導(dǎo)心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡增加,給予GLP-1預(yù)處理后,心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡減少。
　　10.高糖作用下,心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞Rho及ROCK的表達(dá)升高,給予GLP-1預(yù)處理后Rho及ROCK表達(dá)下降,同時(shí)給予PKA抑制劑H89后,Rho及ROCK表達(dá)再次升高。
　　11.分別給予GLP-1或Rho抑制劑fas

15、udil后均可抑制高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞ROS的生成,但同時(shí)給予GLP-1和fasudil并不能進(jìn)一步抑制ROS的生成, H89可逆轉(zhuǎn)GLP-1抑制ROS生成的作用。
　　12.分別給予GLP-1或Rho抑制劑fasudil后均可降低高糖誘導(dǎo)的心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞 p47phox及 gp91phox的表達(dá),但同時(shí)給予 GLP-1和 fasudil并不能進(jìn)一步降低p47phox及gp91phox的表達(dá),H89作用下p47phox