弱毒突變體對野生型馬鈴薯X病毒的交叉保護及二者侵染本氏煙的轉(zhuǎn)錄組學分析.pdf

1、馬鈴薯X病毒(Potato virus X,PVX)屬于馬鈴薯X病毒屬（Potexvirus），主要侵染馬鈴薯、番茄、辣椒、煙草等茄科作物，引起嚴重的病害。如果PVX與馬鈴薯Y病毒屬的病毒共同侵染，會產(chǎn)生協(xié)生作用，引起更為嚴重的癥狀。近年來，關(guān)于PVX基因組結(jié)構(gòu)和功能、株系劃分、寄主抗病機制以及防治技術(shù)等方面研究較多，但是關(guān)于PVX弱毒突變體的篩選及致病機理的研究較少。本文以自主構(gòu)建的PVX侵染性克隆為基礎(chǔ)，利用定點突變的方法獲得突變體

2、，然后從中篩選弱毒突變體，測定了其交叉保護效果;同時利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)分析野生型PVX和一個弱毒突變體侵染本氏煙后的基因表達差異;對弱毒突變體進行改造防治其他多種病毒。主要結(jié)果如下:
　　利用反向遺傳學證明依賴于RNA的RNA聚合酶(RdRp)上四個氨基酸位點的突變都可以降低PVX的致病力。當把PVX RdRp第46位的Glu(E46)、第863位的Asn(N863)、第968位的Asn(N968)、第1001位的Glu(E100

3、1)分別突變?yōu)锳la時都能減輕PVX在本氏煙上的癥狀。Western blotting和Northern blotting檢測結(jié)果表明，四個突變體在寄主體內(nèi)的濃度、正鏈和負鏈RNA的積累水平較野生型均明顯降低。
　　測定了四個弱毒突變體對野生型PVX的交叉保護效果，研究了交叉保護作用機理。保護間隔期為5天時，四個突變體都沒有保護效果。當保護間隔期為10天時，突變體E1001A具有較好的交叉保護效果，保護效率為100％;E46A能延

4、遲發(fā)病;N863A和N968A沒有保護效果。間隔期為15天時，E1001A具有較好的保護效果，保護效率為100％; E46A具有不完全的保護效果，保護效率為33.3％; N863A和N968A依然沒有明顯的保護效果。將E46和E1001同時突變?yōu)锳la，得到雙位點突變體dM，在間隔期為15天時，dM對PVX的保護效率為23.3％。利用Northern blotting檢測了弱毒突變體的siRNA積累水平，證明弱毒突變體的siRNA積累水

5、平與之介導的抗性水平呈正相關(guān)，推測PVX弱毒突變體介導的交叉保護作用機制可能是由siRNA介導的。但是弱毒突變體也能表達衣殼蛋白(CP)，因此不能完全排除CP在交叉保護中的作用。
　　利用數(shù)字基因表達譜測序技術(shù)(DGE)分析了野生型PVX(Pwt)和弱毒突變體(Pat)侵染本氏煙后引發(fā)的基因表達差異。接種后第1天，Pwt使467個基因表達水平發(fā)生變化，GO分析顯示這些基因在DNA代謝過程、DNA復制、葉綠素生物合成過程、葉綠素代謝

6、過程、色素生物合成過程、色素代謝過程、Mg元素螯合酶活性等幾個類別中呈現(xiàn)顯著的富集，KEGG分析顯示DNA復制為顯著富集的代謝通路。接種后第2天，Pwt使1160個基因表達水平發(fā)生變化，這些基因主要富集于光合作用、光合膜、類囊體、類囊體部分、光系統(tǒng)Ⅰ和光系統(tǒng)Ⅱ幾個類別中，顯著富集于光合作用-天線蛋白、光合作用和類胡蘿卜素生物合成幾個代謝通路。接種后第10天，Pwt使1693個基因表達發(fā)生變化，這些基因在生物過程分類中的生物過程、代謝過程

7、、細胞過程、有機物質(zhì)代謝過程、初級代謝過程、細胞代謝過程、大分子代謝過程和細胞大分子代謝過程等類別中呈現(xiàn)最顯著的富集，KEGG分析顯示最顯著富集的途徑為核糖體。推測Pwt侵染可能首先利用了寄主的DNA復制和代謝系統(tǒng)完成自身的復制和增殖，同時也影響了光合色素相關(guān)的基因表達，使光合作用受到影響，從而使生物過程、代謝過程、細胞過程等過程發(fā)生了變化，最終導致癥狀的形成。
　　對數(shù)據(jù)進一步分析發(fā)現(xiàn)，Pwt系統(tǒng)侵染后大多數(shù)與葉綠素代謝相關(guān)的基

8、因、類胡蘿卜素合成相關(guān)的基因都發(fā)生了顯著的上調(diào)，大部分與纖維素合成相關(guān)的基因以及與細胞壁結(jié)構(gòu)相關(guān)的基因都發(fā)生了下調(diào)，這些基因的變化可能是Pwt侵染引起花葉、皺縮癥狀的主要原因之一。此外，Pwt在侵染初期可能通過抑制水楊酸、茉莉酸信號轉(zhuǎn)導途徑從而打破了寄主抗性，在侵染后期使許多與泛素化系統(tǒng)相關(guān)的基因的表達都發(fā)生了顯著的變化，推測這些基因的變化使泛素化參與調(diào)控的植物生理反應(yīng)受到影響，也可能是Pwt侵染引起嚴重癥狀的原因之一。
　　通過

9、對PVX弱毒突變體進行改造獲得了兼抗煙草花葉病毒(TMV)和馬鈴薯Y病毒(PVY)的弱毒疫苗。在TMV和PVY的基因組中各篩選幾個片段，分別克隆到弱毒突變體E1001A中進行交叉保護效果測定，發(fā)現(xiàn)TMV RdRp-2和PVY-7兩個片段分別能誘導對TMV和PVY較好的抗性。將篩選到的兩個最佳片段通過融合PCR聚合后重新連入PVX弱毒突變體E1001A中，得到二聯(lián)弱毒疫苗。溫室測定二聯(lián)疫苗對TMV和PVY介導的交叉保護效果，發(fā)現(xiàn)二聯(lián)弱毒疫