微泡破壞抑制腫瘤生長及其作用機(jī)制研究.pdf

1、背景：惡性腫瘤是目前威脅人類健康的主要疾病之一，在某些國家甚至成為首要的死亡原因?，F(xiàn)在惡性腫瘤主要的治療手段有手術(shù)、放療和化療，其作用的主要機(jī)制在于直接切除腫瘤組織，殺滅腫瘤細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。但是手術(shù)、放療未能從根本上解決抑制腫瘤新生血管形成，控制腫瘤的生長，阻止腫瘤細(xì)胞侵襲和轉(zhuǎn)移等問題。而目前用于腫瘤治療的化療藥物大多缺乏腫瘤細(xì)胞的靶向性并且具有較大的毒副作用，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，也殺傷了大量的骨髓細(xì)胞及其他增殖旺盛的正常細(xì)胞，因

2、此以上治療在臨床應(yīng)用中有很大的局限性。有研究表明，實(shí)體腫瘤的生長依賴于持續(xù)和大量的血管生成，血管生成為腫瘤組織提供營養(yǎng)物質(zhì)和氧氣，同時(shí)血管又是腫瘤細(xì)胞向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要途徑，因此針對血管形成的某些因子及其關(guān)鍵步驟進(jìn)行干預(yù)，有望切斷腫瘤血供及其轉(zhuǎn)移途徑，對腫瘤的治療和防止腫瘤向遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有重要意義。近年來，抗血管治療成為腫瘤治療領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，但是，目前的抗血管新生藥物在臨床的應(yīng)用中有很大的局限性，不同腫瘤或者不同患者的同一腫瘤在抗血管生成的

3、治療中，對藥物的反應(yīng)不同;同時(shí)，單一抗腫瘤藥物必須和化療藥物聯(lián)合使用才能起到抗腫瘤的作用，即便如此腫瘤患者的臨床獲益也非常有限。因此，尋求一種新的安全有效的抗腫瘤血管治療方法便顯得尤為必要。近些年來，隨著超聲學(xué)的發(fā)展，超聲及微泡造影劑在臨床中應(yīng)用的更加廣泛，他們不僅在診斷方面具有極其重要的科學(xué)意義和臨床價(jià)值，而且隨著對超聲領(lǐng)域的深入研究，其在治療方面也顯示出比較誘人的前景。超聲微泡在疾病治療中的主要作用機(jī)制是超聲空化效應(yīng)，所謂超聲空化效

4、應(yīng)就是液體中內(nèi)源性或外源性的微氣泡空化核在超聲作用下發(fā)生振蕩、膨脹、收縮及內(nèi)爆等一系列的動(dòng)力學(xué)過程，它是超聲在液態(tài)物質(zhì)中傳播所特有的現(xiàn)象。既往研究表明微泡破壞產(chǎn)生的空化效應(yīng)可以損傷微血管內(nèi)皮，并對周圍的組織細(xì)胞產(chǎn)生影響，而這種作用有可能為腫瘤的治療提供一種新的方法。接下來的一系列研究顯示:超聲微泡破壞可以損傷腫瘤血管，從而使腫瘤區(qū)域的血流灌注得到明顯減少，其病理變化主要表現(xiàn)為出血、血管擴(kuò)張、組織間水腫、血栓形成。但是這樣的空化效應(yīng)使血流

5、灌注明顯減少能持續(xù)多長時(shí)間，是否能使腫瘤的生長得到抑制，以及是否可以明顯改善荷瘤動(dòng)物的生存率，至今仍未見報(bào)道。同時(shí)，我們預(yù)實(shí)驗(yàn)顯示，超聲微泡破壞治療1分鐘后的病理變化中未發(fā)現(xiàn)明顯的血栓形成，Bunte等在其研究中也顯示同樣的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。那么，什么樣的病理變化使腫瘤在治療后血流灌注明顯減少，目前還不太清楚。目前有大量文獻(xiàn)表明，腫瘤血管在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上與正常血管明顯不同。正常的微血管有動(dòng)脈、靜脈和毛細(xì)血管之分，而實(shí)體瘤的血管沒有動(dòng)靜脈的區(qū)別

6、，其形態(tài)結(jié)構(gòu)主要表現(xiàn)在擴(kuò)張、分叉、迂曲沒有規(guī)律，管壁直徑不均勻，基底膜缺陷，血管外周細(xì)胞不完整等特點(diǎn)?；谝陨侠碚撘罁?jù)，我們假設(shè)腫瘤血管對空化效應(yīng)的機(jī)械性損傷可能更為敏感，超聲微泡破壞有可能更容易損傷腫瘤血管，在達(dá)到抑制腫瘤生長的同時(shí)而不損傷正常組織。以上假設(shè)可以使我們在保證療效的同時(shí)更確保其安全性，這些都可以給腫瘤的治療帶來重要的臨床價(jià)值，但類似的設(shè)想和研究鮮見報(bào)道，更缺乏實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證和機(jī)理解釋。
　　 目的：①通過超聲微泡空化效

7、應(yīng)，觀察微泡破壞能使腫瘤血流灌注減少持續(xù)多長時(shí)間;觀察微泡破壞是否抑制腫瘤的生長;觀察腫瘤小鼠的生存率是否得到明顯提高。②探索超聲微泡破壞使腫瘤血流灌注減少的原因及其機(jī)制。③觀察正常組織血管和腫瘤血管對超聲微泡破壞反應(yīng)的差異及其機(jī)制。從而為腫瘤的治療提供一種安全有效的治療方法及理論依據(jù)。
　　 方法：⑴將建成的腫瘤模型隨機(jī)分為兩組，即超聲治療組(MB+US組)36只，單純微泡組29只。超聲微泡組采用超聲照射聯(lián)合經(jīng)尾靜脈微泡注射;

8、直接抽取“白蛋白”微泡懸液0.02ml，經(jīng)尾靜脈直接注入，進(jìn)行對比增強(qiáng)超聲(CEU)和二維超聲成像，待對比增強(qiáng)超聲成像信號完全消失后，再次經(jīng)尾靜脈注入0.1ml的白蛋白微泡，在腫瘤區(qū)域行超聲破壞治療，治療后再次注入0.02ml的白蛋白微泡，再次進(jìn)行對比增強(qiáng)超聲(CEU)和二維超聲成像。單純微泡組(MB):操作步驟同上，但超聲探頭不發(fā)射超聲脈沖波。⑵腫瘤對比增強(qiáng)超聲檢查:對所有腫瘤模型組經(jīng)尾靜脈隨機(jī)注射MB，處理后對腫瘤組織行對比超聲檢查

9、。動(dòng)物模型制備后，用自制支架固定超聲探頭(17L5)于腫瘤上，調(diào)整探頭位置獲得良好腫瘤顯像后保持探頭位置在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中不變，儀器的各項(xiàng)參數(shù)在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程中保持不變。CEU采用經(jīng)尾靜脈微泡彈丸式注射法進(jìn)行，經(jīng)過一段時(shí)間待血池中循環(huán)微泡完全消失后，經(jīng)尾靜脈再次注入0.1ml造影劑，用上述超聲治療條件進(jìn)行治療，治療后即刻、24h和72h再次注入0.02ml，對實(shí)驗(yàn)小鼠進(jìn)行腫瘤CEU檢查，獲取實(shí)驗(yàn)?zāi)[瘤的顯影圖像。CEU檢查采用二次諧波成像(s

10、econd harmonic imaging)技術(shù)進(jìn)行，探頭發(fā)射頻率(transmission frequency)和接收頻率分(receiving frequency)別為7.0 MHz和14MHz，機(jī)械指數(shù)(Mechanical Index，MI)為0.18。⑶腫瘤二維超聲檢查:每隔5-7天對腫瘤進(jìn)行B-型超聲檢查，每次測量腫瘤最大切面的長徑和短徑，腫瘤體積V=1/2ab2(a:長徑，b:短徑)探頭發(fā)射頻率15 MHz，機(jī)械指數(shù)(M

11、echanical Index，MI)為0.57。全部聲學(xué)圖像存于MO盤，以備脫機(jī)分析。對比超聲圖像的分析:應(yīng)用MCE軟件對超聲圖像進(jìn)行分析，在兩組中隨機(jī)選擇5只小鼠測量治療前、治療后即刻、24h、72h顯影的聲強(qiáng)度(video intensity，VI)。⑷實(shí)驗(yàn)分組:20只S180腫瘤模型隨即分為治療前組、治療后即刻組、治療后24h組和治療后72h組。動(dòng)物模型制備后，經(jīng)尾靜脈注入0.1mi的白蛋白微泡，在腫瘤區(qū)域行超聲破壞治療。免疫組

12、化及組織病理學(xué)檢測:分別在治療前、治療后即刻、24h、72h等四個(gè)時(shí)間點(diǎn)將腫瘤取出，行免疫組化、HE染色。觀察MPO、CD31表達(dá)情況。微血管密度測定方法:采用CD31抗體染色，將與鄰近腫瘤細(xì)胞和結(jié)締組織分離的被染成棕色的內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞簇或分支狀血管結(jié)構(gòu)視為一個(gè)微血管，每個(gè)樣本先在低倍鏡(×100)下觀察陽性染色的微血管，擇染色最多的區(qū)域（即“熱點(diǎn)”），然后選擇5個(gè)不重復(fù)高倍鏡視野，最后計(jì)算單位視野(×200)的平均微血管數(shù)，即MV

13、D。MPO半定量評估:組織免疫組化采用以下得分方法評估，免疫染色的強(qiáng)度分為以下四個(gè)等級:0（無）、1（弱）、2（中等）、3（強(qiáng)）;染色范圍得分可分為以下四個(gè)等級:0(0％)、1(1％-25％)、2(26％-50％)、3（51％-75％）、4(76％-100％)，兩者評分結(jié)果相加即為最終得分。⑸微泡破壞對正常組織及腫瘤組織的不同影響及其機(jī)制。實(shí)驗(yàn)分組:實(shí)驗(yàn)分為腫瘤治療組和正常組織治療組小鼠各5只，分別在小鼠的腫瘤區(qū)域和腿部骨骼肌行相同條件

14、超聲空化治療，實(shí)驗(yàn)步驟及條件同前。免疫組化組織病理學(xué)檢測:分別在治療前、治療后即刻、時(shí)間點(diǎn)將腫瘤取出，行免疫組化、HE染色、免疫熒光檢測。血管成熟程度評估:用cd31抗體特異性標(biāo)記血管內(nèi)皮細(xì)胞，用α-sma特異性標(biāo)記外周細(xì)胞/平滑肌細(xì)胞。血管如果同時(shí)標(biāo)記兩種抗體，表明血管發(fā)育較為成熟，如果只標(biāo)記cd31抗體，表明血管發(fā)育較為幼稚。
　　 結(jié)果：①CEU檢查結(jié)果:CEU圖像顯示腫瘤治療組和對照組均可見顯著的超聲顯影，而腫瘤對照組單

15、純給予微泡造影劑后，超聲顯影無明顯的變化，而超聲治療組在超聲破壞后即刻超聲顯影明顯減弱，治療后24h和72h時(shí)間點(diǎn)造影圖雖可見腫瘤內(nèi)血流灌注信號部分恢復(fù)，但與治療前比較，仍具有顯著性差異。CEU圖像分析及統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果:應(yīng)用CEU軟件對圖像進(jìn)行分析，測量實(shí)驗(yàn)組腫瘤組織不同時(shí)間點(diǎn)顯影的聲強(qiáng)度(video intensity，VI)，并采用彩色編碼技術(shù)制作顯影的彩色編碼圖像。治療前腫瘤區(qū)域的VI值較高，為66.012±4.129,應(yīng)用超聲微

16、泡治療后即刻、24h、72h與治療前的VI值相比較明顯減少，分別是16.677±3.297、26.524±2.193和33.225±19.952(p＜0.001)，有顯著性差異。二維超聲檢查:實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單純超聲微泡組腫瘤的生長沒有得到抑制，而腫瘤治療組在超聲微泡治療后，顯著抑制了腫瘤生長。在腫瘤種植第七天，兩組腫瘤的體積分別為0.315±0.080cm3和0.364±0.135 cm3(p=0.098)，兩者無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，在單

17、純微泡組，腫瘤種植第11、17、25天，腫瘤的平均體積分別為1.112±0.340 cm3、2.526±0.483 cm3和5.718±1.078 cm3，而在超聲治療組，腫瘤種植第11、17、25天，腫瘤的平均體積分別為0.662±0.186 cm3、1.856±0.349 cm3和3.290±0.772 cm3(p＜0.001)，與單純微泡組相比較，明顯抑制了腫瘤的生長。腫瘤小鼠的生存狀況:與單純的微泡組相比較，超聲微泡破壞顯著延長

18、了腫瘤小鼠的生存時(shí)間。單純微泡組小鼠的平均生存時(shí)間是50.931±8.426天，而腫瘤治療組小鼠的平均生存時(shí)間是72.722±10.870天(p＜0.001)，與單純微泡組相比較，有顯著性差異。②免疫組化結(jié)果:免疫組化CD31表達(dá):腫瘤組織在治療前，血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列比較緊密。而在超聲微泡破壞后即刻，血管管腔結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞部分缺失，呈彌散性分布，超聲治療后24小時(shí)、72小時(shí)，仍然看到大量的血管沒有管腔結(jié)構(gòu)，

19、血管內(nèi)皮細(xì)胞連續(xù)性中斷，呈彌散性分布，但在腫瘤的周邊區(qū)域，有少量的新生血管。測量治療前后腫瘤微血管密度結(jié)果顯示:在腫瘤治療前，腫瘤組織有大量的微血管存在，腫瘤治療后即刻、24h、72h后微血管密度明顯減少，和治療前相比較，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)。②免疫組化MPO表達(dá):微泡破壞前，腫瘤組織髓過氧化物酶(MPO)的表達(dá)并不明顯，中性粒細(xì)胞的侵潤并不嚴(yán)重，在腫瘤治療后即刻，髓過氧化物酶的表達(dá)并沒有明顯增加，但治療24h，髓過氧化

20、物酶的表達(dá)明顯增加，到72小時(shí)后，其表達(dá)有所下降，但與治療前相比，仍然是明顯增加。半定量分析顯示:腫瘤治療前，MPO表達(dá)不明顯，染色評分為:1.400±0.548，治療后即刻，評分結(jié)果為:1.600±0.548(p=0.572)，沒有顯著性差異，而在24h，評分結(jié)果為:6.600±0.548(p＜0.001)與治療前相比有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，72h后評分結(jié)果為:3.600±0.548(p＜0.001)與治療前和治療后24h均有顯著性差異。病

21、理學(xué)結(jié)果顯示:腫瘤組織在治療前可見腫瘤細(xì)胞分布呈團(tuán)狀或片狀，排列緊密，細(xì)胞大小不一，核大，深染，核仁明顯，腫瘤組織內(nèi)可見較豐富的微小血管，血管官腔結(jié)構(gòu)相對較完整，組織間未見紅細(xì)胞滲出。腫瘤超聲微泡治療后即刻:腫瘤血管不完整，血管內(nèi)皮連續(xù)性中斷，組織間有大量紅細(xì)胞滲出，腫瘤細(xì)胞并沒有大量壞死。腫瘤細(xì)胞超聲治療24小時(shí)后，腫瘤治療區(qū)域未見有血管結(jié)構(gòu)，組織間滲出的紅細(xì)胞崩解吸收，并出現(xiàn)大量腫瘤細(xì)胞的壞死，主要表現(xiàn)為細(xì)胞核碎裂、溶解。72小時(shí)后

22、，腫瘤組織壞死面積更大。③微泡破壞對正常組織及腫瘤組織的不同影響及其機(jī)制。CEU檢查結(jié)果:彩色編碼圖像顯示，腫瘤組織在超聲破壞后超聲顯影明顯減弱，骨骼肌組織在治療后顯影聲強(qiáng)度雖然也有減弱，但是不太顯著。免疫組化:腫瘤組織在治療前，血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列比較緊密。而在超聲微泡破壞后即刻，血管官腔結(jié)構(gòu)遭到嚴(yán)重破壞，血管內(nèi)皮細(xì)胞部分缺失，呈彌散性分布;骨骼肌組織在治療前，血管的形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，內(nèi)皮細(xì)胞排列比較緊密，治療后，骨骼肌的血管

23、形態(tài)仍然相對完好，內(nèi)皮細(xì)胞排列仍然緊密。測量治療前后腫瘤微血管密度結(jié)果顯示:在腫瘤治療前，腫瘤組織有大量的微血管存在，腫瘤治療后即刻微血管密度明顯減少(p＜0.001)和治療前相比較，有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;骨骼肌治療前微血管密度為:34.400±3.847，治療后微血管密度是:27.000±3.162，有顯著性差異，但是與腫瘤治療相比較，其下降幅度明顯減少。免疫熒光:結(jié)果顯示:治療前，在腫瘤組織中發(fā)育成熟血管在微血管中占很小的比例，約為3

24、1.907±3.911％，在骨骼肌血管中，發(fā)育成熟的血管所占比例較大，約為87.869±3.061％(p＜0.001)，有顯著性差異。在治療后，腫瘤組織中，成熟血管在微血管中所占的比例明顯增高，約為87.851±1.755％，與治療前相比較，有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.001)，骨骼肌組織中，成熟血管所占的比例也有所增高，為90.444±4.298，與治療前比較沒有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.307)。
　　 結(jié)論：⑴超聲微泡破壞使腫