坦布蘇病毒ZC株感染性克隆的構(gòu)建和部分3’非編碼區(qū)功能的初步研究.pdf

1、坦布蘇病毒感染是2010年春季在我國(guó)江浙一帶出現(xiàn)的一種鴨的新發(fā)傳染性疾病。該病發(fā)生迅速，傳播速度快，發(fā)病范圍廣。目前已確定該病毒可以感染多個(gè)品種鴨、鵝等?；记葜饕Y狀為:體溫升高、四肢無(wú)力、癱瘓;產(chǎn)蛋大幅下降;出現(xiàn)頭頸震顫等神經(jīng)癥狀;排草綠色稀便，氣味惡臭。該病感染率可高達(dá)90％以上，死亡率在5％～10％。產(chǎn)蛋期鴨產(chǎn)蛋率由90％左右很快降至20％甚至更低。該病嚴(yán)重影響蛋鴨、種鴨的生產(chǎn)性能，危害著我國(guó)水禽業(yè)的健康發(fā)展。
　　坦布蘇病

2、毒為正鏈RNA病毒，病毒粒子直徑約50nm，有囊膜，基因組大小為10，990個(gè)核苷酸，含有一個(gè)長(zhǎng)的開放閱讀框，其編碼的多聚蛋白經(jīng)水解、剪切、加工后形成3種結(jié)構(gòu)蛋白（衣殼蛋白、膜蛋白前體和囊膜蛋白）和7種非結(jié)構(gòu)蛋白（非結(jié)構(gòu)蛋白1、2A、2B、3、4A、4B和5）。ORF兩端分別為3'和5'非編碼區(qū)，長(zhǎng)度分別為94個(gè)核苷酸和618個(gè)核苷酸。相關(guān)研究表明黃病毒屬成員非編碼區(qū)形成的二級(jí)結(jié)構(gòu)與病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄和毒力有關(guān)。本研究中我們對(duì)分離鑒定的兩

3、株水禽源坦布蘇病毒進(jìn)行全基因組序列測(cè)定與分析;并選取一株鴨源分離株構(gòu)建感染性克隆和病毒拯救，為研究病毒基因組結(jié)構(gòu)和功能、病毒編碼蛋白功能和分子致病機(jī)理提供技術(shù)支持;利用建立的坦布蘇病毒反向遺傳操作平臺(tái)和融合PCR技術(shù)，對(duì)3'端CS序列和次末端堿基進(jìn)行了點(diǎn)突變，以探究基因組中兩種結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能。
　　1.坦布蘇病毒Taqman探針實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR方法的建立
　　根據(jù)Genbank公布的TMUV的NS1基因中保守序列設(shè)

4、計(jì)了一對(duì)引物和中間一條Taqman探針，建立了一種適用于TMUV檢測(cè)的熒光定量RT-PCR方法。結(jié)果顯示，該方法標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=-2.9227x+42.083，R2=0.9972;特異性強(qiáng)，H9亞型禽流感病毒、新城疫病毒、鴨瘟病毒、鴨甲型肝炎病毒、鴨呼腸孤病毒和鴨圓環(huán)病毒等可感染鴨病原核酸模板擴(kuò)增結(jié)果均為陰性;靈敏性高，最低檢測(cè)敏感度為29copies/μL。該方法適用于TMUV核酸的快速檢測(cè)，可應(yīng)用于空氣中、棉拭子樣品直接檢測(cè)，缺點(diǎn)是需

5、要昂貴的儀器設(shè)備。
　　2.兩株坦布蘇病毒的分離鑒定和全基因組測(cè)序分析
　　對(duì)送檢的疑似坦布蘇病毒感染的發(fā)病鴨、鵝進(jìn)行了病原的分離和鑒定。參考Genbank中收錄的TMUV全基因組序列，設(shè)計(jì)6對(duì)引物引物，結(jié)合5'race RT-PCR技術(shù)進(jìn)行了兩株TMUV分離株的全基因組序列測(cè)定和分析。結(jié)果成功分離到1株鴨源(ZC株)和1株鵝源（LQ株）的TMUV。接種9日齡鴨胚測(cè)得ELD50分別為10-4.2/mL和10-3.6/mL。動(dòng)

6、物回歸試驗(yàn)顯示兩株分離株均可引起雛鴨典型的神經(jīng)癥狀。全基因組核苷酸序列同源性分析表明，LQ株和ZC株與SX1株同源關(guān)系最近，分別為99.1％和99％。E和NS1蛋白氨基酸同源性分析表明，兩株分離株與其他TMUV分離株之間沒(méi)有明顯的遺傳變異。親緣關(guān)系最遠(yuǎn)的FJMH220株、AH2011株和GX2013G株三株TMUV均為番鴨源，TMUV毒株之間是否存在宿主差異性還有待進(jìn)一步研究。
　　3.坦布蘇病毒反向遺傳操作的建立
　　根據(jù)

7、TMUV ZC株全基因組測(cè)序結(jié)果結(jié)合Genbank中收錄的TMUV全基因組序列以及酶切位點(diǎn)分析，設(shè)計(jì)了7對(duì)引物進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。對(duì)低拷貝載體pWSK29進(jìn)行多克隆位點(diǎn)的改造并命名為pWSK29C。將各段依次克隆至pWSK29C中，在5'末端加入T7啟動(dòng)子序列和TAA轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，并引入ApaⅠ酶切位點(diǎn);在3'末端加入T7RNA酶識(shí)別終止序列，在序列上、下游分別引入AvrⅡ和ⅣotⅠ酶切位點(diǎn)，構(gòu)建的感染性克隆質(zhì)粒中(C10495G)位點(diǎn)

8、突變作為分子標(biāo)簽，構(gòu)建的感染性克隆質(zhì)粒(命名為pWSK29C-DTMUV)。該質(zhì)粒經(jīng)ⅣotⅠ酶切線性化后，通過(guò)T7體外轉(zhuǎn)錄為具有感染性的RNA，純化后轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72h后凍融三次，離心收集上清，對(duì)收獲的拯救毒株進(jìn)行鑒定。測(cè)序顯示結(jié)果成功構(gòu)建了TMUV ZC株的感染性克隆質(zhì)粒，并引入T7轉(zhuǎn)錄元件和酶切位點(diǎn);RT-PCR檢測(cè)為陽(yáng)性;間接免疫熒光反應(yīng)顯示其與TMUV Mab12B1具有良好的反應(yīng)性;全基因組序列分析顯示，104

9、95位分子標(biāo)簽具有穩(wěn)定的遺傳性;致病性試驗(yàn)顯示，拯救株ZC1株的ELD50為10-3.8/mL，毒力略高于親本株，拯救株ZC1株與親本株ZC株感染雛鴨均出現(xiàn)明顯的癥狀，病毒的一步生長(zhǎng)曲線和雛鴨感染后存活曲線也相似。構(gòu)建的TMUV反向遺傳操作為研究TMUV的基因組結(jié)構(gòu)和功能、病毒編碼蛋白功能以及分子致病機(jī)理等方面的研究提供了技術(shù)支持。
　　4.3'非編碼區(qū)功能的初步研究
　　以構(gòu)建的ZC株感染性克隆質(zhì)粒pWSK29C-DTMU

10、V為骨架，進(jìn)行3'端保守序列和次末端堿基的突變，并進(jìn)行毒株的拯救和鑒定，進(jìn)而分析3'非編碼區(qū)部分結(jié)構(gòu)的生物學(xué)功能。病毒基因組cDNA序列經(jīng)酶切位點(diǎn)分析在9761位AgeⅠ限制性酶切位點(diǎn)為單一酶切位點(diǎn)。將CS序列前后片段分別擴(kuò)增后，采用融合PCR技術(shù)進(jìn)行CS缺失片段的擴(kuò)增，經(jīng)雙酶切后克隆至pWSK29C-DTMUV中，構(gòu)建CS序列缺失感染性克隆重組真核表達(dá)質(zhì)粒。首輪進(jìn)行PCR擴(kuò)增至TMUV基因組10985位，以擴(kuò)增產(chǎn)物為模板進(jìn)行3'次末端

11、點(diǎn)突變片段的擴(kuò)增，經(jīng)雙酶切克隆至pWSK29C-DTMUV中，構(gòu)建3'次末端堿基點(diǎn)突變感染性克隆重組真核表達(dá)質(zhì)粒。突變質(zhì)粒經(jīng)NotⅠ酶切線性化后，經(jīng)T7RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄獲得感染性RNA，轉(zhuǎn)染BHK21細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)72h，凍融三次離心后收集上清。將收獲的病毒液進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示，除CS1序列缺失毒株沒(méi)有成功拯救外，其他毒株均成功拯救。在該位點(diǎn)突變毒株拯救過(guò)程中，C→G突變并未顯著影響病毒的增殖，而缺失或突變?yōu)锳、T堿基卻使得病毒增殖