雞貧血病毒突變體感染性克隆的構(gòu)建及病毒拯救.pdf

1、雞貧血病毒(Chicken anemia virus，CAV)是危害養(yǎng)雞業(yè)的重要免疫抑制病病原之一，該病毒基因共編碼VP1、VP2和VP3三個(gè)蛋白，每個(gè)蛋白在其感染過(guò)程中作用不同，且相互關(guān)聯(lián)。本研究在課題組前期分離、鑒定CAV臨床毒株及構(gòu)建了病毒感染性克隆pcDNA-2CAV的基礎(chǔ)上，對(duì)病毒的三個(gè)蛋白重要功能區(qū)的部分氨基酸進(jìn)行定點(diǎn)突變，構(gòu)建含點(diǎn)突變CAV基因的重組質(zhì)粒進(jìn)行體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)，并進(jìn)行病毒拯救。
　　（一）構(gòu)建雙拷貝CAV

2、突變體感染性克隆
　　參考本實(shí)驗(yàn)室分離的CAV基因序列，運(yùn)用Megaprimer PCR突變方法分別對(duì)病毒VP1第394位氨基酸（決定病毒致病性氨基酸谷氨酰胺）、VP2第101位氨基酸（磷酸化基序中精氨酸）、VP3起始位點(diǎn)氨基酸（甲硫氨酸）和VP3第85位氨基酸（核定位信號(hào)內(nèi)絲氨酸）進(jìn)行定點(diǎn)突變。通過(guò)設(shè)計(jì)定點(diǎn)突變引物擴(kuò)增出含點(diǎn)突變的全基因組序列，分別連接到pEASY-Blunt Zero載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，利用載體攜帶的

3、自殺基因和菌液PCR篩選陽(yáng)性克隆，并送往生物公司測(cè)序;將含有正確突變的重組質(zhì)粒，經(jīng)KpnⅠ和XhoⅠ雙酶切并膠回收純化目的片段，與真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)連接。再通過(guò)PCR獲得兩端含KpnⅠ酶切位點(diǎn)的CAV全基因組，與KpnⅠ單酶切的單拷貝感染性克隆突變體順次連接、轉(zhuǎn)化并鑒定。結(jié)果顯示，本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建出雙拷貝CAV突變體克隆，根據(jù)點(diǎn)突變的位置及功能不同將構(gòu)建的突變體克隆分別命名為pcDNA-2CAV-VP1Q394、pcDNA

4、-2CAV-VP2R101、pcDNA-2CAVΔVP3和pcDNA-2CAV-VP3S85。
　?。ǘ〤AV突變病毒的拯救
　　首先利用SPF雞胚檢測(cè)上述構(gòu)建的突變重組質(zhì)粒對(duì)于機(jī)體組織的侵染性。將7日齡SPF雞胚隨機(jī)分組，經(jīng)卵黃囊接種不同突變重組質(zhì)粒和對(duì)照樣品，每組3個(gè)重復(fù)，將雞胚繼續(xù)孵化至第19天進(jìn)行剖檢，觀察病變并采集胸腺等組織應(yīng)用PCR方法分析病毒特異性基因。結(jié)果顯示，僅有接種pcDNA-2CAV-VP1Q394實(shí)

5、驗(yàn)組雞胚腿肌有出血。病毒特異性基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組的突變CAV基因存在于SPF雞胚組織內(nèi)，說(shuō)明這些突變重組質(zhì)粒侵染雞胚后可能復(fù)制增殖病毒。
　　為了獲得在MSB1細(xì)胞系上具有增殖能力的感染性突變體，將上述構(gòu)建的四種質(zhì)粒通過(guò)脂質(zhì)體3000轉(zhuǎn)染MSB1細(xì)胞，進(jìn)行病毒拯救。通過(guò)熒光染色觀察第5代細(xì)胞凋亡情況，并以PCR和Western blotting方法分別檢測(cè)病毒基因和蛋白在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)情況。結(jié)果顯示，在細(xì)胞傳代過(guò)程中除了VP3缺失實(shí)驗(yàn)

6、組外都能檢測(cè)到突變病毒基因，不同突變組發(fā)生凋亡情況存在差異，且在侵染后除VP3缺失突變組外均能檢測(cè)到病毒相關(guān)蛋白的表達(dá)。以上結(jié)果證明，成功構(gòu)建了CAV突變體感染性克隆，這些突變體克隆能夠?qū)SB1細(xì)胞產(chǎn)生不同侵染效應(yīng)。將拯救得到的病毒侵染正常細(xì)胞，并將細(xì)胞進(jìn)行傳代，通過(guò)標(biāo)簽檢測(cè)發(fā)現(xiàn)只有pcDNA-2CAV-VP1Q394拯救病毒侵染組存在突變病毒，且將此拯救病毒命名為CAVVP1Q394。
　　綜上所述，本研究對(duì)CAV的VP1、V