鯊魚軟骨多糖的分離純化及其抗類風濕性關節(jié)炎作用機制研究.pdf

1、類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis，RA)是一種常見的以慢性多關節(jié)炎癥為主要表現(xiàn)的全身性自身免疫性疾病。通過對RA的發(fā)病機制研究，抗炎治療已經(jīng)成為RA治療的一個重要原則。近年來，糖胺聚糖類藥物的抗炎作用的研究已有報道，本課題選擇了鯊魚軟骨中的糖胺聚糖的抗炎作用進行研究。 鯊魚軟骨多糖主要包括硫酸角質素(keratan sulfate，KS)、硫酸軟骨素(chondroitin sulfatase，CS)和

2、透明質酸(hyaluronic acid，HA)等，均屬于糖胺聚糖類化合物。硫酸軟骨素A(CSA)和硫酸軟骨素C(CSC)都是由葡萄糖醛酸與硫酸化的N-乙酰氨基半乳糖通過B1→3糖苷鍵組成的二糖單位為主要重復雙糖單位，只是硫酸基的位置不同。雙糖之間通過B1→4糖苷鍵連接形成線形分子。硫酸角質素由半乳糖與6-硫酸-N-乙酰氨基半乳糖通過B1→4糖苷鍵組成的二糖單位為主要重復雙糖單位，雙糖之間通過B1→3糖苷鍵連接形成線形分子，它是鯊魚軟骨

3、多糖成分中唯一不含糖醛酸的糖胺聚糖。研究發(fā)現(xiàn)鯊魚軟骨多糖除了具有傳統(tǒng)的治療神經(jīng)痛、偏頭痛和抗腫瘤等活性外，還具有一定的抗類風濕性關節(jié)炎功能。 本課題研究了各種鯊魚軟骨多糖對RA大鼠的治療作用，探討了各種鯊魚軟骨多糖對RA炎癥過程中的RatIL-6和Rat IL-12表達和mRNA轉錄的影響。此外，還研究了各種鯊魚軟骨多糖對明膠酶活性的影響。 1鯊魚軟骨多糖的分離和純化將精制的鯊魚軟骨多糖提取物經(jīng)Q Speharose

4、<'TM> Fast Flow強離子交換柱層析進行分離，Sephadex G-15凝膠柱脫鹽后，獲得組成相對單一的組分，在醋酸纖維素薄膜電泳中顯示單一條帶。 2 鯊魚軟骨多糖的結構分析 利用紅外光譜(IR)、核磁共振光譜(<'1>H-NMR、<'13>C-NMR)分析結果確定鯊魚軟骨多糖的主要分子結構。紅外光譜結果顯示，SCP-3、SCP-4與SCP-5結構中含有羥基、羰基和酰胺結構，并含有硫酸基，且后兩者硫酸基含

5、量較高。而SCP-3中不含有羧基，其結構中可能不含有糖醛酸，提示其可能為KS。SCP-1與SCP-2結構中不含有硫酸基，可能為HA。 3 鯊魚軟骨多糖對Rat IL-6和Rat IL-12分泌的影響 建立大鼠RA模型，利用x線分析確定各組大鼠炎癥情況。結果顯示，SCP-3、SCP-4、SCP-5三種鯊魚軟骨多糖具有減輕炎癥反應、降低大鼠足跖腫脹度的作用。研究了SCP-3、SCP-4、SCP-5三種鯊魚軟骨多糖對RA大

6、鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子IL-6、IL-12的影響，以及不同給藥濃度對RA大鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子IL-6、IL-12的影響。結果顯示，模型組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液中Rat IL-6含量為635.93±92.03 pg/mL，．明顯高于陰性對照組(367.84±57.66 pg/mL)(P<0.05)。三種鯊魚軟骨多糖用藥組Rat IL-6含量分別是SCP-3組：472.33±75.82 pg/mL；SCP-4組：434.4±

7、28.06 pg/mL；SCP-5組：440.07±36.79 pg/mL。其中SCP-4與SCP-5對巨噬細胞IL-6分泌有顯著性抑制作用(P<0.05)，而SCP-3效果并不明顯(P>0.05)。 模型組大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清液中，Rat IL-12含量為222.73±19.42pg/mL，明顯高于陰性對照組(33.93±14.40 pg/mL)(P<0.05)。三種鯊魚軟骨多糖用藥組Rat IL-12含量分別是SCP-3

8、組：80.54±17.42 pg/mL SCP-4組：64.6±22.11 pg/mL；SCP-5組：65.18±15.54 pg/mL。其中SCP-4組和SCP-5組與模型組比較，具有顯著性差異(P<0.05)，而SCP．3組無顯著性差異(P<0.05)。 不同給藥濃度對RA大鼠腹腔巨噬細胞分泌細胞因子IL-6、IL-12的影響實驗結果顯示，不同SCP的給藥濃度對大鼠腹腔巨噬細胞培養(yǎng)上清中Rat IL-6、RatIL-12

9、的含量均有一定的影響。當給藥濃度為250 μg/mL，時，各給藥組RatIL-6、Rat IL-12含量為最低。 4 鯊魚軟骨多糖對RatIL-6和Rat IL-12 mRNA 轉錄的影響 采用RT-PCR對大鼠腹腔巨噬細胞Rat IL-6和Rat IL-12 mRNA表達水平進行半定量分析。通過對內(nèi)參照g-actin和Rat IL-6、Rat IL-12退火溫度的摸索，確定其最佳退火溫度分別為54℃、61℃、56℃。在

10、反應條件優(yōu)化的基礎上，比較了模型組、SCP-3組、SCP-4組、SCP-5組巨噬細胞中mRNA量的變化，結果顯示SCP-3、SCP-4和SCP-5給藥組的平均積分光密度值均小于模型組。其中以SCP-5給藥組的平均積分光密度值最小，說明三種SCP對Rat IL-6和Rat IL-12 mRNA轉錄均有一定的抑制作用，以SCP-5的抑制作用最顯著。 5 鯊魚軟骨多糖對明膠酶活性的影響 研究了鯊魚軟骨多糖對明膠酶活性的影響，結

11、果顯示，三種鯊魚軟骨多糖的抑制作用強弱依次為SCP-4>SCP.3>SCP.5，并且SCP-3、SCP-4、SCP-5對明膠酶活性的作用呈現(xiàn)劑量依賴性。當濃度較高時(≥2 mg/mL)，三種多糖均表現(xiàn)出一定的促進明膠酶活性的作用，低濃度時表現(xiàn)為抑制作用且隨濃度降低SCP-3、SCP-4抑制作用先升高再降低；當濃度達到3.2×10<'-3>mg/mI時，抑制作用最強；當濃度再降低時，其抑制作用減弱。SCP-5的抑制作用在0.4～2.56×

12、lO<'-5>mg/mL濃度范圍內(nèi)，隨濃度的降低而升高。 本研究取得的主要成果有： (1)首次觀察了不同鯊魚軟骨多糖組分對RA發(fā)病中Rat IL-6、Rat IL-12活性的影響，以及對RatIL-6、RatIL-12 mRNA轉錄的影響。結果顯示，鯊魚軟骨 多糖對RA 模型大鼠中Rat IL-6、Rat IL-12活性和mRNA的表達具有抑制作 用，說明鯊魚軟骨多糖作用于RA發(fā)病過程中的不同環(huán)節(jié)。 (2)首