人免疫球蛋白可變區(qū)基因擴增方法的優(yōu)化及抗?jié)h坦病毒免疫噬菌體抗體庫的建立.pdf

1、前言：
　　 漢坦病毒(hanta vims,HV)可引起一種以發(fā)熱、出血、腎功能損害和免疫功能紊亂為突出表現(xiàn)的急性傳染性疾病,即腎綜合征出血熱(Hemorrhagic feverwith renal syndrome,HFRS)。我國是受漢坦病毒危害最為嚴重的國家,發(fā)病人數(shù)占全球總數(shù)的90%以上。HFRs的發(fā)病機制復(fù)雜,好發(fā)人群多為青壯年,并發(fā)癥多,病死率高達1～15%。目前HFRS的診斷和抗病毒藥物仍未取得令人滿意的效果,造

2、成本病的誤診、漏診及無特效的治療方法,致使死亡率居高不下。鑒于抗體(antibody,Ab)對抗原(anti gen,Ag)的特異性識別是多數(shù)疾病診斷和治療的基礎(chǔ),病毒性疾病尤其如此,因此開發(fā)新型基因工程抗體是提高HFRS診斷敏感性及治療效果的重要途徑。
　　 近年來,治療性單克隆抗體(monoclonalantibodies,mAbs)發(fā)展迅速,已成為免疫治療的重要手段。據(jù)統(tǒng)計,目前有25個mAbs已經(jīng)被批準應(yīng)用于臨床治療,超

3、過200個mAbs已在臨床實驗階段,并且保持著每年約14%的增長率。噬菌體抗體庫技術(shù)是研制mAbs的有效方法,其利用基因工程的方法將全套人抗體重鏈及輕鏈可變區(qū)基因克隆出來,并在噬菌體表面表達、分泌,經(jīng)篩選后獲得特異性抗體。應(yīng)用噬菌體抗體庫技術(shù),國內(nèi)外學者已先后建立起了多種抗體庫。但是,由于多數(shù)病毒抗原表位復(fù)雜,病毒變異快,致病機理復(fù)雜以及噬菌體抗體本身存在的親和力相對較低等原因,目前還沒有噬菌體抗體用于病毒性疾病臨床治療的報道。

4、　　 抗體庫的親和篩選主要依賴于抗體庫中抗體的親和性和多樣性,保持抗體的高親和力可避免與其他抗原非特異性結(jié)合而引起的副作用?？贵w親和力大體和庫容成正比,因此建立大庫容的抗體庫是獲得高親和性抗體的首要任務(wù)?？贵w重鏈(heavychainvariableregion,VH)及輕鏈(lightchainvariableregion,VL)可變區(qū)基因的擴增是獲得高容量噬菌體抗體庫及分析抗體功能的關(guān)鍵步驟。為了大量擴增抗體基因片段,研究者根據(jù)抗

5、體中某些序列的相對保守性設(shè)計一系列相應(yīng)引物,利用不同的PCR技術(shù)簡單有效地擴增出全套抗體可變區(qū)(variableregion,V/FV)基因。一旦多樣的免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)可變區(qū)基因能夠擴增,從噬菌體抗體庫中即能得到針對不同抗原的特異性抗體。許多研究者試圖通過設(shè)計通用引物或一套引物擴增人全部可變區(qū)基因序列,如應(yīng)用Sblattero設(shè)計的引物擴增可變區(qū)基因建立抗體庫,但這些研究中的引物是根據(jù)當時的人Ig數(shù)據(jù)庫設(shè)

6、計的。近年來,數(shù)據(jù)庫中胚系基因序列的不斷更新,使得胚系基因的數(shù)量及多樣性有了很大提高,所以這些引物已經(jīng)不能涵蓋現(xiàn)今數(shù)據(jù)庫中的全部Ig可變區(qū)基因。
　　 本研究擬根據(jù)最新的國際免疫遺傳學數(shù)據(jù)庫(theinternationalImMunoGene-Ticsinformationsystem,IMGT)和IgBLAST數(shù)據(jù)庫的胚系基因序列,通過開放的簡并引物設(shè)計平臺iCODEHOP和手動設(shè)計兩種方式設(shè)計新的可變區(qū)基因引物,對獲得的可

7、變區(qū)基因的多樣性及單鏈抗體(SinglechainFvfragment,ScFv)的連接效率進行分析,為構(gòu)建大容量抗?jié)h坦病毒免疫噬菌體抗體庫以及篩選獲得可用于HFRS患者快速診斷和免疫治療的高親和力抗體奠定基礎(chǔ)。
　　 方法：
　　 一、VH基因的引物設(shè)計
　　 首先,從IMGT和IgBLAST數(shù)據(jù)庫獲得了全部胚系基因序列,根據(jù)編碼VH基因框架區(qū)(Frameworkregion,FR)1的胚系基因V片段(VH)基

8、因家族的不同,分成7組VH(229個蛋白序列)。然后應(yīng)用BlockMaker服務(wù)器將同一家族內(nèi)的序列進行比對,找出高度保守區(qū)域。在獲得的保守區(qū)基因序列中使用iCODEHOP生物信息學軟件的默認參數(shù)設(shè)計VH5'引物。編碼VH基因FR4的胚系基因J片段(JH)有13個核苷酸序列放在一組中自行找出保守區(qū)。3'引物是通過13個JH核苷酸序列的保守區(qū)手動設(shè)計。
　　 二、VH基因的擴增
　　 從沈陽市傳染病院共獲得HFRS恢復(fù)期患

9、者外周血30份,每位患者取外周血5mL,用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞。參照RNA提取試劑盒使用說明,提取總RNA。按照TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Version3.0說明進行第一鏈反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板,應(yīng)用自主設(shè)計的寡核苷酸引物混合物(ConsensusDE-generateHybridOligonucleotidePrimers,CODEHOP),應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerabechainreacti

10、on,PCR)擴增抗體重鏈可變區(qū)基因。PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。使用凝膠回收試劑盒純化后連入PMD18-T載體中,使用通用引物對多個單克隆進行測序分析。
　　 三、人全部Ig可變區(qū)基因的套式PCR引物設(shè)計
　　 從數(shù)據(jù)庫中獲得人Ig重鏈(VH)、輕鏈(包括VK和VL)胚系基因序列:前導序列(Leadersequence,L)、V基因片段、J基因片段、恒定區(qū)(Constantregion,C)。根據(jù)胚系基因家族

11、的不同分組,在每組中通過多序列對比軟件GeneDoc進行分析,手動設(shè)計引物。
　　 四、人全部Ig可變區(qū)基因的擴增
　　 以cDNA為模板,應(yīng)用針對不同胚系基因家族的第一套引物分別擴增人重鏈和輕鏈可變區(qū)基因。將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定,使用凝膠回收試劑盒回收目的基因片段。以純化的目的片段為模板,用第二套引物擴增可變區(qū)基因,再將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后純化。
　　 五、ScFv基因的拼接及

12、鑒定
　　 (一)重疊延伸PCR(genesplicingbyoverlapextensionPCR,SOE-PCR)拼接ScFv基因
　　 將第二套引物擴增后回收的VH、VK(L)基因片段隨機組合、分次連接,按常規(guī)SOE-PCR法進行連接反應(yīng),連接后電泳鑒定并純化。
　　 (二)ScFV基因的鑒定
　　 PCR產(chǎn)物凝膠回收后連接pMD18-T載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)菌TG1,提取多個單克隆后送至TAKARA公司

13、測序分析。
　　 六、抗?jié)h坦病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建
　　 (一)ScFv與噬粒載體連接
　　 ScFv的連接產(chǎn)物凝膠回收后經(jīng)sfi1、Not1雙酶切,用片段純化試劑盒進行回收。將其與Sfi1、Not1雙酶切的噬粒載體pCANTAB5E連接。將全部連接產(chǎn)物加入至100μL感受態(tài)菌E.coliTG1中進行轉(zhuǎn)化,轉(zhuǎn)化產(chǎn)物一部分凍存,一部分涂于SOBAG瓊脂平板上,37℃過夜培養(yǎng)。挑取SOBAG瓊脂板上的單菌落,提取

14、質(zhì)粒進行酶切鑒定后,送測序。
　　 (二)抗體庫的構(gòu)建及容量測定
　　 900μL凍存菌種加入至9.1mL2×YT-G培養(yǎng)基中,37℃培養(yǎng)1h,向培養(yǎng)物中加入50μL,20mg/mLAmp和4×1010pfu的M13K07(加入的體積=4×1010pfu÷M13K07pfu/mL。37℃培養(yǎng)1h,1000g離心10min,棄上清,10mL2×YT-AK培養(yǎng)基重懸后,37℃過夜培養(yǎng)。將所得文庫做10-8、10-10、10-

15、12、10-14、10-16梯度稀釋,進行噬菌斑培養(yǎng)實驗,觀察噬菌斑生長情況以估算ScFv噬菌體抗體庫的滴度。
　　 結(jié)果：
　　 一、VH基因的引物設(shè)計
　　 應(yīng)用iCODEHOP設(shè)計簡并引物共獲得7條5'引物。根據(jù)13條胚系基因J片段的核苷酸序列手動設(shè)計獲得1條3'引物,分別與7條5'引物配對使用。這套引物可以擴增人Ig重鏈可變區(qū)FR1至FR4。
　　 二、VH基因的擴增
　　 應(yīng)用自主設(shè)計的

16、引物,經(jīng)RT-PCR擴增獲得VH基因。每對引物擴增的基因大小都與預(yù)期一致,大小約為3501bp,由于5'引物的結(jié)合位點不同導致產(chǎn)物片段大小有些許差異。
　　 三、VH基因多樣性分析
　　 為了鑒定PCR產(chǎn)物的特異性和多樣性,將PCR產(chǎn)物純化,克隆入PMD18-T載體中,轉(zhuǎn)化TG1菌,多個單克隆提取后測序,序列分析均為人Ig重鏈可變區(qū)基因。對編碼VH基因序列的胚系基因來源進行了分析,顯示了其多樣性。
　　 四、人全

17、部Ig可變區(qū)基因的套式PCR引物設(shè)計
　　 根據(jù)胚系基因數(shù)據(jù)庫手動設(shè)計兩套引物,第一套引物的結(jié)合位點為前導序列和恒定區(qū):其中VH5'引物6條,3'引物2條,VK5'引物6條,3'引物1條,VL5'引物7條,3'引物1條,共形成25種組合。第二套引物的結(jié)合位點為V區(qū)和J區(qū),并且在引物中引入了國際通用linker序列:其中VH5'引物5條,3'引物1條,VK5'引物4條,3'引物2條,VL5'引物7條,3'引物2條,共形成27種組合

18、。VH引物5'端引入了酶切位點Sfi1,VK(L)3'端引入了酶切位點Not1。
　　 五、全套VH、VL基因片段的擴增和鑒定
　　 (一)用第一套引物擴增可變區(qū)基因片段
　　 以cDNA為模板,PCR擴增后,VH基因片段大小約為500多bp,VK、VL基因片段大小約為400bp,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 (二)用第二套引物擴增可變區(qū)基因片段
　　 以第一套引物擴增的可變區(qū)基因片段純化產(chǎn)物為模板,P

19、CR擴增后,VH、VK、VL基因片段大小約為350bp,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 六、單鏈抗體的拼接及鑒定
　　 (一)SOE-PCR拼接ScFv基因
　　 將5種VH基因片段與22種VK/NL基因片段兩兩配對連接,共獲得40種VH-liker-VK和70種VH-linker-VL組合。拼接后的ScFv大小為750bp,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 (二)ScFv的測序鑒定
　　 測序結(jié)果表明,ScFv包

20、含完整的可變區(qū)基因框架區(qū)、互補決定區(qū),在VH、VL基因中間為正確的linker序列,與預(yù)期結(jié)果一致。
　　 七、抗?jié)h坦病毒免疫噬菌體抗體庫的構(gòu)建
　　 (一)噬粒載體pCANTAB5E-ScFv的鑒定
　　 用EcoR1單酶切載體pCANTAB5E及pCANTAB5E-ScFv,大小分別為4.5kb、5.4kb,與預(yù)期結(jié)果相符。將多個單克隆測序分析驗證了ScFv基因的正確性及多樣性。
　　 (二)噬斑測定

21、抗體庫容量
　　 對10個稀釋倍數(shù)為10-14的噬斑平板計數(shù),取平均值。測定抗體庫的容量為2.9×1016。
　　 結(jié)論：
　　 1、應(yīng)用iCODEHOP設(shè)計了VH5'引物7條,手動設(shè)計VH3'引物1條;
　　 2、PCR擴增獲得了VH基因,經(jīng)測序分析顯示了序列的多樣性;
　　 3、手動設(shè)計兩套Ig可變區(qū)引物,采用套式PCR成功擴增獲得VH、VK、VL基因片段;
　　 4、采用SOE-RC