雞免疫球蛋白的分離純化及其ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、雞源疾病種類(lèi)繁多，隨著養(yǎng)禽業(yè)的迅速發(fā)展，對(duì)禽病的早期診斷和控制尤顯重要。雞血清中IgG水平的測(cè)定，已是臨床免疫檢驗(yàn)和體液免疫研究的常用指標(biāo)?？闺uIgG的單克隆抗體與常規(guī)免疫血清相比，具有特異性高，效價(jià)穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，研制抗雞免疫球蛋白單克隆抗體旨在為多種禽病的診斷提供高質(zhì)量、標(biāo)準(zhǔn)化試劑，對(duì)進(jìn)一步研究雞傳染病具有十分重要的現(xiàn)實(shí)意義。 本論文分為兩部分，第一部分主要研究了雞血清免疫球蛋白的分離純化，第二部分主要是建立了檢測(cè)鼠抗雞IgG抗

2、體的間接ELISA方法。 應(yīng)用硫酸銨分步沉淀和乙醇沉淀兩種方法粗提雞血清免疫球蛋白，將兩種方法提取的免疫球蛋白用進(jìn)行SDS—PAGE電泳檢測(cè)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，兩種方法粗提的免疫球蛋白都較純，硫酸銨鹽析獲得的免疫球蛋白得率大，乙醇沉淀粗提的免疫球蛋白得率小。然后將兩種方法粗提的免疫球蛋白過(guò)SephadexG-200凝膠柱進(jìn)一步分離純化雞血清IgG，經(jīng)免疫電泳和SDS-PAGE電泳檢測(cè)，純化的IgG達(dá)到了電泳純，SDS-PAGE電泳可

3、見(jiàn)純化的雞IgG出現(xiàn)兩條帶，分別為其重鏈和輕鏈，免疫電泳結(jié)果只出現(xiàn)一條帶，純度較高。且得知IgG重鏈(H鏈)的分子量大約為65KD，輕鏈(L鏈)的分子量為25KD。Folin-酚法測(cè)得層析蛋白濃度為1mg/mL，滿(mǎn)足了后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。 用純化的雞血清IgG作為抗原，以皮內(nèi)多點(diǎn)注射大白兔及其昆明系普通小鼠制備兔抗雞IgG免疫血清和鼠抗雞IgG免疫血清。采用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(Enzyme LinkedImmunosorbentAss

4、ay)和瓊脂擴(kuò)散實(shí)驗(yàn)測(cè)多克隆抗體效價(jià)，兔抗雞血清IgG抗體瓊擴(kuò)效價(jià)達(dá)到1:8，ELISA效價(jià)達(dá)到1:5 12000，鼠抗雞血清IgG抗體瓊擴(kuò)效價(jià)為1:2，ELISA效價(jià)為1:128000。 本研究還建立了篩選陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞的間接ELIsA法，通過(guò)方陣法優(yōu)化出以下最佳反應(yīng)條件。雞。IgG包被的間接ELISA篩選方法：抗原最適包被量為0.5μg/mL，陽(yáng)性和陰性血清稀釋度為1:2000，酶標(biāo)抗體羊抗鼠IgG-HRP的稀釋度為1:10