雞卵黃免疫球蛋白及卵磷脂的分離純化.pdf

1、研究雞卵黃免疫球蛋白的分離純化方法，為IgY替代哺乳動物血清IgG進(jìn)行免疫學(xué)檢測診斷研究奠定基礎(chǔ)。同時，從卵黃分離WSF后的廢渣中提取卵磷脂，以實現(xiàn)對雞蛋的綜合利用。 對3種IgY分離純化方法進(jìn)行比較研究，建立優(yōu)化提取工藝。采用SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行IgY純度分析，瓊脂雙向免疫擴(kuò)散實驗測定IgY效價，單向瓊脂免疫擴(kuò)散實驗測定IgY含量。 ①水稀釋法結(jié)合鹽析沉淀、離子交換色譜純化IgY，確定最優(yōu)條件為：卵黃液10倍水

2、稀釋，調(diào)pH至5.3，-18℃凍結(jié)6h，4℃解凍，添加3％硅藻土進(jìn)行微濾(0.45μm混合纖維素酯膜)，超濾(5萬分子截留量聚醚砜膜)濃縮五倍，采用45％飽和硫酸銨鹽析，沉淀重溶后經(jīng)DEAE-SepharoseF.F.柱層析分離純化，可從高免雞蛋中得到電泳純IgY，總活性回收率達(dá)到64.16％。 ②水稀釋法結(jié)合PEG沉淀提取IgY：卵黃液經(jīng)水稀釋-凍融微濾法去脂及超濾濃縮后，采用10％或12％PEG沉淀純化IgY，可獲得電泳純I

3、gY，IgY回收率達(dá)50％以上。 ③水稀釋-辛酸法結(jié)合冷乙醇沉淀提取IgY：卵黃液經(jīng)水稀釋法去脂，1％正辛酸沉淀去除殘留脂肪及部分雜蛋白，經(jīng)60％與30％冷乙醇分段沉淀，IgY回收率為39.02％，純度為74.92％。 結(jié)果表明，水稀釋-膜過濾法提取、鹽析沉淀、離子交換色譜法純化IgY，所得產(chǎn)品純度和回收率均高于其他兩種方法，且分離條件溫和，對抗體活性影響小，對檢測診斷用IgY而言，是較好的分離純化方法。PEG沉淀法也不

4、失為一種較理想的提取較高純度卵黃抗體的純化方法，可在室溫下進(jìn)行，并不易使蛋白質(zhì)變性，操作簡便、快速。采用辛酸提取結(jié)合冷乙醇沉淀純化IgY，由于有機(jī)溶劑的使用，其對抗體活性有較大影響，而且溶劑耗用量大，并需要多步離心操作，制約了進(jìn)一步工業(yè)化生產(chǎn)的應(yīng)用。 嗜硫色譜作為一種新型蛋白質(zhì)純化技術(shù)，在抗體純化領(lǐng)域有著廣闊的應(yīng)用前景。主要進(jìn)行了其介質(zhì)制備的基礎(chǔ)研究，采用巰基乙酸反應(yīng)檢測介質(zhì)活性基團(tuán)含量，研究了介質(zhì)制備過程影響偶聯(lián)反應(yīng)的主要因素

5、，包括反應(yīng)pH值、巰基乙酸濃度與反應(yīng)時間等。 卵磷脂的提取純化采用有機(jī)溶劑法，確定氯仿-甲醇提取和丙酮-乙醚-乙醇純化工藝為：選擇氯仿∶甲醇(1∶1.5V/V)為提取溶劑，濾餅與溶劑比為1∶4(W/V)，室溫下攪拌萃取30min，經(jīng)pH8.34預(yù)冷(0℃)丙酮(粗磷脂∶丙酮=1∶2W/V)沉淀，再分別用乙醚和乙醇溶解，獲得純化的卵磷脂，產(chǎn)品用硅膠TLC分析，卵磷脂純度較高，得率為8.14％。 通過實驗方案，對卵黃免疫球蛋