甘藍(lán)SCR、THL與SRK交替相互作用的酵母雙雜交檢測.pdf

1、植物的自交不親和性(self-incompatibility,SI)是為了避免白花受精而進(jìn)化出的重要遺傳機(jī)制。甘藍(lán)SI的分子過程是由存在于花粉中的S-位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(S-locuscystein-richprotein,SCR)亦稱為S位點(diǎn)蛋白11(S-locusprotein11,SP11)識別結(jié)合柱頭上的S受體激酶基因(Sreceptorkinasegene,SRK)啟動(dòng),將原本結(jié)合于SRK上的負(fù)調(diào)控因子類硫氧還蛋白(Thio

2、redoxin-likeprotein,THL)釋放出來,然后通過目前尚未完全知曉的分子過程,實(shí)現(xiàn)自交不親和性。SRK(S位點(diǎn)受體激酶)、SCR/SP11(S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白/S位點(diǎn)蛋白11)和THL1(類硫氧還蛋白)是甘藍(lán)自交不親和性信號傳導(dǎo)過程的重要的三個(gè)元件。本研究利用酵母雙雜交技術(shù)探討甘藍(lán)SCR、THL與SRK交替相互作用的關(guān)系。
　　 本研究利用PCR技術(shù)獲得兩種甘藍(lán)SCR2(classⅡ)、eSRg2(class

3、Ⅱ)、THL1、SRKJ(classⅠ,SRK6激酶域)和eSRKzs(classⅠ)的編碼序列,并分別構(gòu)建以pGBKT7為載體的SCR2、THL1的重組“誘餌”質(zhì)粒和以pGADT7為載體的eSRK2、eSRK28、SRKJ的重組“獵物”質(zhì)粒。利用酵母雙雜交系統(tǒng)驗(yàn)證eSRK2-SCR2,eSRK28-SCR2,SRKJ-THL1的相互作用。重組質(zhì)粒在宿主細(xì)胞中未產(chǎn)生毒性及自激活作用,表明重組表達(dá)載體構(gòu)建成功;試驗(yàn)組合Y2HGold[pG

4、BKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]在三缺平板(SD/-Trp-Leu-His/x-a-gaFAbA,TDO/x/A)上生長出藍(lán)色克隆,激活了報(bào)告基因AUR1-C、MEL1、HIS3;實(shí)驗(yàn)組合Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]能夠在二缺平板(SD/-Trp-Leu)生長,但在三缺平板培養(yǎng)基上不生長,表明不同單倍型SRK-SCR可能不發(fā)生相互作用;實(shí)驗(yàn)組Y187[pGAD

5、T7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]能夠在四缺平板培養(yǎng)基上生長,激活了4種報(bào)告基因(AUR1-C、MEL1、HIS3、ADE2)。相同的單倍型SRK與SCR之間能夠相互作用,不同的單倍型之問不會發(fā)生相互作用;酵母中報(bào)告基因表達(dá)的數(shù)目和類型的差異所反映了classⅡ型內(nèi)部的SCR-SRK和classⅠ的SCR-SRK互作強(qiáng)度,Ⅰ型高于Ⅱ型;THL與SRK之間存在較高的互作強(qiáng)度。這為Ⅰ型和Ⅱ型不同的自交不親和性表型所依

6、賴的三個(gè)起始信號傳導(dǎo)元件之間的識別程度差異提供了直接證據(jù)和新內(nèi)容。主要研究結(jié)果總結(jié)如下:
　　 1.Ⅰ型和Ⅱ型的SCR2及eSRK2的基因克隆及序列分析
　　 擴(kuò)增的eSRK2位于第一個(gè)外顯子的74bp～1321bp之間,編碼了416個(gè)氨基酸。VectorNTIAdvance分析Ⅰ和Ⅱ型的SRK氨基酸序列,發(fā)現(xiàn)classⅡ型的eSRK之間的相似性要高于classⅠ型。ClassⅡ型中的S-2、S-5和S-15之間的序列相

7、似性達(dá)到93%～97.3%;classⅠ型的S-1、S-7、S-8、S-14、S-11、S-24和S-29之間氨基酸序列相似性比classⅡ型要低一些。比對分析發(fā)現(xiàn)Ⅰ和Ⅱ型的氨基酸序列在219～330的氨基酸區(qū)間和446～460的氨基酸區(qū)間呈現(xiàn)較大的差異,classⅠ型的氨基酸存在部分缺失。
　　 本研究擴(kuò)增的是SCR2的第二個(gè)外顯子,共編碼65個(gè)氨基酸。應(yīng)用VectorNTIAdvance分析不同的SCR氨基酸序列顯示了擬南芥

8、和甘藍(lán)氨基酸序列的趨異。在class-Ⅰ型中不同單倍型SCR氨基酸的相似度為20～76%;class-Ⅱ型中不同單倍型SCR蛋白質(zhì)序列兩兩之間的相似度達(dá)到63～94%。Class-Ⅰ型SCR的4個(gè)半胱氨酸殘基高度保守,另外4個(gè)半胱氨酸殘基所處的位置略有差異;而class-Ⅱ型SCR的8個(gè)半胱氨酸殘基高度保守。
　　 2.誘餌蛋白毒性及其自激活檢測分析和pGADT7-SRK毒性檢測分析
　　 pGBKT7-SCR2質(zhì)粒的菌

9、落出現(xiàn)在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal平板上為白色菌落;pGBKT7-THL1質(zhì)粒在SD/-Trp和SD/-Trp/x-a-gal的平板上出現(xiàn)了生長狀態(tài)良好,菌斑與空載pGBKT7大小相近、菌斑密度均無明顯差異,證明轉(zhuǎn)入的表達(dá)蛋白對酵母無毒害作用。pGBKT7-SCRzpGBKT7-THL1在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上沒有菌落生長。pGBKT7-SCR:和pGBKT7-TH1質(zhì)粒的酵母細(xì)胞中沒有激活報(bào)告

10、基因AUR1-C和MEL1,沒有發(fā)生自身的轉(zhuǎn)錄激活作用。
　　 pGADT7-SRKJ和pGADT7-eSRK2在SD/-Leu平板上生長狀態(tài)良好。而且其對照pGADT7斑點(diǎn)大小及生長時(shí)間與pGADT7-eSRK2pGADT7-SRKJ一致,說明表達(dá)蛋白對酵母菌無毒害作用。
　　 3.SCR2與eSRK2;eSRK28與SCR2;SRKJ與THL1相互作用檢測
　　 Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGo

11、ld[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]都能在DDO/x/A平板上長出明顯的藍(lán)色菌落,激活了報(bào)告基因AUR1-C和MEL1;Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK28]在DDO/x/A平板上未長出藍(lán)色菌落,初步判斷沒有相互作用。為更進(jìn)一步檢測相互作用的可能性,排除假陽性和假陰性的出現(xiàn);而后將DDO/x/A平板上的藍(lán)色克隆劃線至TDO

12、/x/A和QDO/x/A平板上,4天后發(fā)現(xiàn)涂有Y2HGold[pGBKT7-SCR2]×Y187[pGADT7-eSRK2]的TDO/x/A在平板上呈藍(lán)色,而QDO/x/A平板上酵母菌株沒有生長的跡象,由此可表明報(bào)告基因HIS3也能被激活,而報(bào)告基因ADE未激活。而Y187[pGADT7-SRKJ]×Y2HGold[pGBKT7-THL1]和Y2HGold[pGBKT7-SCR28]×Y187[pGADT7-eSRK/s]在TDO/x/