應(yīng)用酵母雙雜交系統(tǒng)研究甘藍(lán)自交不親和決定因子的相互作用.pdf

1、自交不親和性(SI)在許多顯花植物中普遍存在，是阻止自體受精、預(yù)防近親繁殖和促進(jìn)遠(yuǎn)系雜交、保持遺傳多樣性的一種重要機(jī)制。倍受關(guān)注的甘藍(lán)等蕓苔屬植物的SI反應(yīng)，涉及從授粉到受精過(guò)程中發(fā)生的花粉配體和雌蕊受體之間的相互作用，在經(jīng)典遺傳學(xué)中受假設(shè)的孟德?tīng)栁稽c(diǎn)--S位點(diǎn)控制。柱頭對(duì)花粉的識(shí)別取決于S位點(diǎn)呈現(xiàn)緊密連鎖以及高度多態(tài)性的兩個(gè)基因：①雄性專一性決定因子--S-位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(SCR)、亦稱為S位點(diǎn)蛋白11(SP11)，該基因編碼開(kāi)

2、放閱讀框內(nèi)含高頻率的半胱氨酸殘基，在花藥中積累并特異表達(dá)，為PCP家族中具有親水性的小分子堿性分泌蛋白。②雌性決定因子--受體激酶基因(SRK)，編碼一種跨膜的蛋白激酶，由N端胞外域(S域)、跨膜域和一個(gè)具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的C端胞內(nèi)域組成；該基因有7個(gè)外顯子，其中胞外S結(jié)構(gòu)域由第一個(gè)外顯子編碼，是花粉配體結(jié)合位點(diǎn)，決定自交不親和性的特異識(shí)別反應(yīng)，從而引起柱頭乳突細(xì)胞SI信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終導(dǎo)致自交不親和反應(yīng)。
　　 本研究利用

3、酵母雙雜交系統(tǒng)鑒定甘藍(lán)自交不親和決定因子S位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋/S位點(diǎn)蛋白11(SCK/SP11)與S位點(diǎn)受體激酶(SRK)胞外域(eSRK)片段間可能的相互作用區(qū)域。以結(jié)球甘藍(lán)B3為材料，利用分子克隆技術(shù)，分別構(gòu)建以pGBKT7為載體的全長(zhǎng)SCRB3、SCRB3-1、SCRB3-2的重組誘餌質(zhì)粒；以pGADT7為載體的全長(zhǎng)采用RT-PCR擴(kuò)增不同片段長(zhǎng)度的、eSRKB3-1、eSRKB3-2的重組激活域(AD)質(zhì)粒。建立了適用于SCR與

4、SRK相互作用的酵母雙雜交檢測(cè)體系，初步確定了SCR與eSRK存在相互作用，SRK跨膜域的存在與否對(duì)其相互作用的研究沒(méi)有影響。為我們更深入的研究SCR與SRK相互作用機(jī)理，提供了理論基礎(chǔ)。主要研究結(jié)果總結(jié)如下：
　　 1.不同截短長(zhǎng)度S-位點(diǎn)富含半胱氨酸蛋白(SCR)基因(SCRB3-s)的克隆及其結(jié)構(gòu)特征以結(jié)球甘藍(lán)B3幼葉的gDNA和開(kāi)花1-2d的花蕾總cDNA為模板，采用PCR擴(kuò)增不同片段長(zhǎng)度的SCRB3-s基因。經(jīng)1％(w

5、/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，SCRB3-s的目的片段大小均與引物的理論擴(kuò)增值大小相符，SCRB3中含有302bp的內(nèi)含子。利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建酵母雙雜交誘餌表達(dá)載體，DNA測(cè)序結(jié)果分析表明，pGBKT7-SCRB3-s喝載體中包含有SCRB3-s片段且插入的SCRB3-s片段序列與SP1128序列完全一致。采用Vector NTI Advance10.0對(duì)不同S單倍型的6個(gè)SCR/SP11(S6、S8、S13、S28、S54、Sf2)進(jìn)行

6、序列比對(duì)，不同S單倍型SCR/SP11蛋白之間較大的“一致性和相似性”差異揭示SCR/SP11較高的多態(tài)性。SCRB3共編碼85個(gè)氨基酸，包含完整的信號(hào)肽和成熟肽；SCRB3-1包含了SCR蛋白信號(hào)肽C端的3個(gè)氨基酸VEA和完整的成熟肽；SCRB3-2包含成熟肽部分的58個(gè)氨基酸。
　　 2.不同截短長(zhǎng)度的S位點(diǎn)受體激酶(SRK)胞外域(eSRK)片段(eSRKB3-s)的克隆及其結(jié)構(gòu)特征采用PCR和RT-PCR擴(kuò)增不同片段長(zhǎng)度

7、的eSRKB3-s，經(jīng)1％(w/v)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，目的片段大小均與引物的理論擴(kuò)增值大小相符；且分別以gDNA和cDNA擴(kuò)增的目的片段大小一致，表明eSRKB3-s中沒(méi)有內(nèi)含子。利用分子克隆技術(shù)成功構(gòu)建酵母雙雜交AD表達(dá)載體pGADT7-eSRKB3-s，DNA測(cè)序結(jié)果分析表明，pGBKT7-eSRKB3-s載體中包含的eSRKB3-s片段序列與eSRK28序列完全一致。BLAST在線分析結(jié)果表明，eSRKB3編碼426個(gè)氨基酸，包

8、含了SRK蛋白B-Lectin結(jié)構(gòu)域、SLG結(jié)構(gòu)域和PAN_APPLE結(jié)構(gòu)域，是SRK胞外域的全長(zhǎng)；eSRKB3-1是去除信號(hào)肽區(qū)域的eSRK序列，編碼第30位至第426位氨基酸；eSRKB3-2包含了eSRK序列的高變區(qū)域，編碼第140位至第426位氨基酸。
　　 3.酵母雙雜交重組誘餌質(zhì)粒的毒性及自激活檢測(cè)Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-s]和Y2HGold[pGBKT7]轉(zhuǎn)化株在缺陷型SD/-Trp平板上生長(zhǎng)狀態(tài)

9、良好，并且菌斑大小無(wú)明顯差異；由此表明誘餌質(zhì)粒pGBKT7-SCRB3-s的表達(dá)對(duì)酵母細(xì)胞無(wú)毒性作用。另外，Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-s]在缺陷型SD/-Trp、SD/-Trp/x-a-gal平板上均能生長(zhǎng)、在SD/-Trp/x-a-gal/AbA平板上不生長(zhǎng)，其中在SD/-Trp/x-a-gal平板上生長(zhǎng)的菌落無(wú)明顯藍(lán)色出現(xiàn)，說(shuō)明pGBKT7-SCRB3-s在酵母細(xì)胞中沒(méi)有激活報(bào)告基因AUR1-C和MEL1。
　

10、　 4.酵母雙雜交重組AD質(zhì)粒的毒性及自激活檢測(cè)將pGADT7空載和pGADT7-eSRKB3-s轉(zhuǎn)化Y187，觀察得到Y(jié)187[pGADT7]和Y187[pGADT7-eSRKB3-s]在SD/-Leu平板上生長(zhǎng)狀態(tài)良好，由此表明重組表達(dá)質(zhì)粒pGADT7-eSRKB3-s成功轉(zhuǎn)入酵母細(xì)胞Y187且無(wú)毒性作用。此外，Y187[pGADTT-eSRKB3-s]在SD/-Leu平板上呈現(xiàn)生長(zhǎng)狀態(tài)良好的白色菌斑；在SD/-Leu/x-a-g

11、al平板上沒(méi)有明顯藍(lán)色克隆出現(xiàn)。由此可說(shuō)明pGADT7-eSRKB3-s重組載體在酵母細(xì)胞中沒(méi)有激活報(bào)告基因MEL1，無(wú)自身的轉(zhuǎn)錄激活作用發(fā)生。
　　 5.SCRB3-s與eSRKB3-s片段間相互作用檢測(cè)利用生物信息學(xué)分析軟件對(duì)SCRB3與eSRKB3進(jìn)行相互作用分析，結(jié)果表明SCRB3與eSRKB3在空間能夠相互識(shí)別形成融合蛋白。
　　 SCRB3-s與eSRKB3-s片段間兩兩組合的9個(gè)試驗(yàn)組均能在DDO平板上出現(xiàn)

12、生長(zhǎng)狀態(tài)良好的菌斑，其中有Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-2]×Y187[pGADTT-eSRKB3-2]、Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-2]×Y187[pGADT7-eSRKB3-1]、Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-1]×Y187[pGADT7-eSRKB3-2]和Y2HGold[pGBKT7-SCRB3-1]×Y187[pGADT7-eSRKB3-1]4個(gè)試驗(yàn)組能在QDO/x/A平板上出現(xiàn)藍(lán)色克隆，