sCAR-4N1融合蛋白的原核表達及在白血病治療中的研究.pdf

1、背景:白血病(Leukemia)又稱“血癌”,其作為一種常見的造血系統(tǒng)惡性疾病,是嚴(yán)重危害人類身體健康的惡性疾病之一。目前白血病的治療還是以化療、骨髓移植為主,但多數(shù)患者只能獲得短暫緩解,最終因復(fù)發(fā)或耐藥而死亡。Thrombospondins中文名血小板反應(yīng)蛋白,是一個胞外蛋白參與細胞與細胞和細胞矩陣通信的家族。Thrombospondin-1,是一種具有毒性從而促使癌細胞凋亡的蛋白,已有研究結(jié)果表明,TSP-1抑制白血病主要的作用部位

2、關(guān)鍵是TSP-1的羧基端4N1。CAR(Coxsackie and adenovirus receptor)為柯薩奇病毒腺病毒受體,它可與5型腺病毒所結(jié)合,從而介導(dǎo)5型腺病毒Ad-EGFP有效侵染白血病細胞。本課題立足于腫瘤靶向基因一病毒治療(Targeting Gene-Virotherapy)的策略,以溶瘤腺病毒為載體,根據(jù)thrombospondin-1(TSP-1)羧基端4N1氨基酸序列(RFYVVMWK),以已有的腺病毒受體s

3、CAR為模板,將8個氨基酸序列通過PCR擴增于sCAR之后,得到目的序列sCAR-4N1,連接到表達載體pQE30上,轉(zhuǎn)化大腸桿菌M15后獲得工程菌。該菌株經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后,高效表達出帶有組氨酸標(biāo)簽以包涵體形式存在的融合蛋白sCAR-4N1,用于抗白血病的研究。
　　 目的及意義:本課題根據(jù)白血病細胞表面表達CD47,而正常細胞表面CD47表達量相對較少的特點,將其作為特異性清除白血病細胞的理想靶點。通過原核,表達純化出能夠特異

4、靶向白血病細胞的sCAR-4N1蛋白,該蛋白羧基端可以與白血病細胞表面的CD47整聯(lián),以達到靶向并有效侵染白血病細胞的作用。本課題構(gòu)建的融合蛋白sCAR-4N1,能夠抑制白血病細胞增殖,并誘導(dǎo)其凋亡的作用。此外,本課題設(shè)計了攜帶4N1和IL-24兩個抑癌基因的5型腺病毒sCAR-4N1-IL-24,根據(jù)白血病細胞表面表達CD47,而正常細胞表面不表達CD47的特點,設(shè)計并構(gòu)建了能夠特異靶向白血病細胞的溶瘤腺病毒Ad.hCMV-sCAR-

5、4N1-sp-E1A-△E1B-hCMV-IL-24,該病毒期望通過融合蛋白sCAR-4N1、Survivin啟動子、IL-24三者的協(xié)同作用,清除白血病細胞,以期望達到治愈白血病的目的。
　　 方法:一、構(gòu)建攜帶融合基因sCAR-4N1的質(zhì)粒;二、融合蛋白sCAR-4N1原核表達并純化;三、通過體外細胞實驗鑒定蛋白sCAR-4N1殺傷性;四、構(gòu)建包含兩個外源表達框(hCMV-sCAR-4N1和hCMV-IL-24)的穿梭質(zhì)粒;

6、五、HEK293細胞中通過同源重組包裝目的病毒,以用于以后白血病的抗癌效果研究。
　　 結(jié)果:成功構(gòu)建含融合基因sCAR-4N1質(zhì)粒,在大腸桿菌M15中成功表達sCAR-4N1融合蛋白sCAR-4N1。純化后進行的體外實驗表明此蛋白能夠達到抑制白血病細胞K562增殖,并誘導(dǎo)其凋亡,且對正常細胞殺傷作用較小。
　　 結(jié)論:本課題通過原核表達成功純化的特異性靶向殺滅白血病細胞的融合蛋白sCAR-4N1體外抗白血病效果顯著,為