載雷公藤內(nèi)酯PEG-PLA聚合物膠束研究.pdf

1、雷公藤內(nèi)酯（triptolide，TP）具有顯著的抗炎、免疫抑制、抗腫瘤和抗生育作用，在臨床上已用于治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、皮膚病、腎炎等疾病。近年來(lái)，TP因抗瘤譜廣、抗瘤活性強(qiáng)而引起了人們極大的關(guān)注。TP難溶于水，對(duì)多種器官系統(tǒng)，如消化系統(tǒng)、泌尿系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、骨髓和血液系統(tǒng)具有嚴(yán)重的毒性。本論文制備了載雷公藤內(nèi)酯的聚合物膠束（triptolide loaded polymeric micelles，TP-PM），并

2、對(duì)TP-PM的抗腫瘤作用、對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響、急性毒性、亞急性毒性進(jìn)行了研究，為制備一種治療實(shí)體瘤的雷公藤內(nèi)酯新制劑提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。此外，我們采用微乳作為載體，制備了包載雷公藤內(nèi)酯的微乳凝膠（triptolide-loaded hydrogel-thickened microemulsion，TP-MTH），以期通過(guò)皮膚給藥降低TP的毒性或提高療效，本論文對(duì)TP-MTH治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的藥效學(xué)進(jìn)行了研究。全文完成的工作包括以下幾方面

3、： 1. 以單甲醚聚乙二醇（MePEG）、D,L－丙交酯為原料，以辛酸亞錫為催化劑，合成了單甲醚聚乙二醇－聚乳酸（MePEG-PLA）兩親性兩嵌段共聚物。用1H-NMR、FT-IR、GPC和芘熒光探針對(duì)其結(jié)構(gòu)和性質(zhì)進(jìn)行了表征。結(jié)果顯示MePEG和丙交酯發(fā)生了酯化反應(yīng)，共聚物的分子量為2.8×104，臨界膠束濃度為8.9×10-7 mol/L，表明合成的嵌段共聚物在水溶液中能夠形成穩(wěn)定的膠束。 2. 以合成的MePEG-

4、PLA嵌段共聚物為載體材料，采用溶劑蒸發(fā)法制備載雷公藤內(nèi)酯的聚合物膠束。用激光粒度儀、透射電鏡、RP-HPLC對(duì)聚合物膠束進(jìn)行表征。結(jié)果所制備的聚合物膠束粒徑為80 nm 左右，包封率>65％，多分散指數(shù)<0.3，聚合物膠束呈核殼結(jié)構(gòu)的球形粒子，分散均勻，表面光滑，形態(tài)規(guī)整，沒(méi)有粘附和聚集現(xiàn)象。TP-PM體外釋放緩慢，24 h累計(jì)釋放百分率為67％，在4℃下儲(chǔ)存4月，無(wú)明顯聚集與分層現(xiàn)象，聚合物膠束的粒徑、Zeta電勢(shì)、包封率無(wú)明顯變化

5、，穩(wěn)定性好。 3. 以人卵巢癌細(xì)胞株A2780為體外細(xì)胞模型、以小鼠荷S180移植瘤為體內(nèi)動(dòng)物模型，考察了TP-PM的抗腫瘤作用及對(duì)荷瘤小鼠免疫功能的影響。TP-PM和TP在1～50μg/L的濃度范圍內(nèi)，在作用48 h或72 h后對(duì)A2780細(xì)胞的增殖均具有明顯的抑制作用，抑制強(qiáng)度具有時(shí)間依賴性和濃度依賴性，TP-PM和TP的作用強(qiáng)度相似。用Hochest33258染色在熒光顯微鏡下觀察了藥物在10 μg/L濃度時(shí)作用72 h的

6、細(xì)胞形態(tài)，可見(jiàn)腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)核固縮、碎裂、邊聚等細(xì)胞凋亡表現(xiàn)。TP-PM低、中、高劑量組（0.0375，0.075，0.15 mg/kg，尾靜脈注射，6次，隔日一次）對(duì)荷瘤小鼠腫瘤生長(zhǎng)的抑制率分別為42.5％、46.0％、49.9％，高于同劑量TP組。腫瘤組織病理學(xué)檢查顯示TP-PM組和TP組腫瘤呈現(xiàn)壞死性改變。與模型組相比，TP明顯抑制胸腺指數(shù)、血清IL-2和TNF-α水平、ConA誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化率，脾臟異常增大，表現(xiàn)出明顯的免疫抑

7、制作用，而TP-PM對(duì)上述指標(biāo)無(wú)明顯影響。上述結(jié)果表明，聚合物膠束能夠保持或增強(qiáng)TP的抗腫瘤作用，并且能夠降低TP免疫抑制的副作用。 4. 研究了TP-PM對(duì)小鼠的急性毒性和對(duì)大鼠的亞急性毒性，并與TP進(jìn)行比較。小鼠靜脈注射TP-PM的LD50 值為1.06 mg/kg，TP的LD50 值為0.83 mg/kg。雄性大鼠靜脈注射TP-PM或TP（0.1 mg/kg/d、0.3 mg/kg/d，×14 d），與生理鹽水組相比，TP

8、-PM對(duì)血清ALT、AST、BUN、Cr和GSH-Px的水平無(wú)明顯影響，明顯降低MDA水平、提高SOD活性，TP組的血清AST水平和睪丸組織ACP活性顯著降低、胸腺系數(shù)、睪丸系數(shù)降低、脾系數(shù)顯著增大。TP組的脾臟、睪丸呈現(xiàn)明顯病理性改變，腎和肝呈現(xiàn)輕微病理性改變，TP-PM組中上述器官的病理?yè)p傷較TP組輕。與同劑量TP比較，TP-PM能夠明顯增加睪丸ACP活性、明顯降低血清MDA水平。結(jié)果表明，TP有明顯的免疫毒性和生殖毒性，輕度的肝、

9、腎毒性。而TP-PM對(duì)上述器官的毒性較TP明顯降低，降低脂質(zhì)過(guò)氧化損傷可能是TP-PM毒性較低的原因之一。 5. 觀察雷公藤內(nèi)酯微乳凝膠（TP-MTH）皮膚給藥的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。與空白凝膠組相比，雷公藤內(nèi)酯微乳凝膠在20～120 μg/kg劑量范圍內(nèi)（以雷公藤內(nèi)酯計(jì)）能抑制二甲苯致小鼠的耳廓腫脹，低、中、高劑量組的抑制率分別為46.7％、47.8％和49.5％，TP-MTH 低、中、高劑量組對(duì)棉球所致大鼠肉芽組織增生的抑制率分別

10、為17.9％、28.5％和40.9％，能顯著抑制角叉菜膠致大鼠的足趾腫脹，對(duì)佐劑性關(guān)節(jié)炎大鼠的繼發(fā)性病變具有明顯的治療作用，能抑制醋酸所致小鼠扭體反應(yīng)，延長(zhǎng)熱板致痛的潛伏期。結(jié)果表明TP-MTH具有良好的抗炎和鎮(zhèn)痛作用。 本論文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明聚合物膠束保持或增強(qiáng)了雷公藤內(nèi)酯的抗腫瘤作用，并且降低了雷公藤內(nèi)酯免疫抑制的副作用以及對(duì)生殖系統(tǒng)、肝、腎等器官的毒性，有望成為雷公藤內(nèi)酯靜脈給藥治療實(shí)體瘤的有效載體。雷公藤內(nèi)酯微乳凝膠透皮給藥