雞貧血病毒VP1、VP2基因在巴斯德畢赤酵母中的表達及產(chǎn)物免疫保護性研究.pdf_第1頁
已閱讀1頁,還剩63頁未讀, 繼續(xù)免費閱讀

下載本文檔

版權說明:本文檔由用戶提供并上傳,收益歸屬內(nèi)容提供方,若內(nèi)容存在侵權,請進行舉報或認領

文檔簡介

1、本研究根據(jù)GenBank已公布的CAV的VP1和VP2基因序列,利用Oligo6.0分子生物學軟件分別設計擴增引物,從已構建的載體pBluemCAV重組質粒中分別擴增出VP1及VP2基因,并將擴增出的片段插入畢赤酵母表達載體pPIC9K中,分別構建成重組質粒pPIC9K-VP1和pPIC9K-VP2,將構建好的載體均用SalI線性化后,分別轉化給酵母SMD1168細胞,經(jīng)PCR鑒定、甲醇誘導表達、SDS-PAGE、Dot-Elisa和W

2、esternblot試驗,結果表明:CAVVP1基因能夠分泌表達,在約50KD處出現(xiàn)特異帶,經(jīng)紫外分光光度計測量,重組VP1蛋白在上清中的含量約為15μg/ml;VP2基因經(jīng)破碎酵母細胞,釋放胞內(nèi)蛋白,在約30KD處出現(xiàn)特異帶;經(jīng)凝膠分析儀分析,紫外分光光度計測量,VP2蛋白古酵母總蛋白的21%。表達蛋白量約為25μg/ml,均屬于高效表達。Dot-Elisa結果顯示被檢重組蛋白CAVVP1及CAVVP2都出現(xiàn)特異性顏色反應應;免疫印記

3、試驗表明重組蛋白CAVVP1能夠與針對CAVVP1的單克隆抗體反應,在50KD處出現(xiàn)特異帶,具有良好的反應原性,重組蛋白CAVVP2與針對CAVVP1的單克隆抗體未見反應。分別將重組CAVVP1、CAVVP2蛋白乳化后,免疫6周齡BALBB/c鼠,分離血清,Elisa試驗結果顯示所得血清分別可以與全病毒反應;IFA試驗免疫重組蛋白CAVVP1制得的多克隆血清可以和感染CAV的MDCC-MSB1反應,而VP2沒有反應。 本研究優(yōu)化

4、了發(fā)酵條件與表達產(chǎn)量的關系,確定重組酵母表達CAVVP1及CAVVP2蛋白的最佳條件為:30℃,pH6.0,溶氧值40%,空氣流量1.25vvm,當確定甘油耗盡時,通過分批補料的方式進行甲醇補料,誘導表達,最終OD600可達到250或更高,通過比較不同溫度下保存重組蛋白的降解率得出表達蛋白保存于-20℃。這一工作為CAVVP1及CAVVP2蛋白的大規(guī)模發(fā)酵表達和應用打下了良好的基礎。 將發(fā)酵表達的重組蛋白CAVVP1、CAVVP

5、2經(jīng)薄層膠掃描、紫外分光光度計定量后,與等體積FREEJND’SADJUVANT(SIGMA公司)乳化后,分為對照組、CAVVP1、CAVVP1+CAVVP2三組,分別胸肌注射10日齡CAV陰性SPF雛雞,免疫前后均采血,分離血清,Elisa試驗顯示免疫3周CAVVP1+CAVVP2組可檢測劍抗體,直到4周CAVVP1+CAVVP2組抗體滴度有所升高,5周達到最高滴度,6周后抗體滴度成平穩(wěn)趨勢,CAVVP1組3周可檢測到較低抗體,之后抗

6、體水平未見升高,對照組成陰性反應;1FA試驗結果表明CAVVP1+CAVVP2組免疫3周后可檢測到微弱的中和抗體,4周后可見較強熒光,CAVVP1組和對照組均未見到熒光。同時將乳化后的重組蛋白CAVVP1、CAVVP2分為對照組、CAVVP1、CAVVP1+CAVVP2三組,分別胸肌注射無免種雞,監(jiān)測血清及卵黃抗體滴度,Elisa結果顯示CAVVP1+CAVVP2組5周血清和卵黃抗體水平同時達到最高,之后波動較小,CAVVP1組及對照組

溫馨提示

  • 1. 本站所有資源如無特殊說明,都需要本地電腦安裝OFFICE2007和PDF閱讀器。圖紙軟件為CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.壓縮文件請下載最新的WinRAR軟件解壓。
  • 2. 本站的文檔不包含任何第三方提供的附件圖紙等,如果需要附件,請聯(lián)系上傳者。文件的所有權益歸上傳用戶所有。
  • 3. 本站RAR壓縮包中若帶圖紙,網(wǎng)頁內(nèi)容里面會有圖紙預覽,若沒有圖紙預覽就沒有圖紙。
  • 4. 未經(jīng)權益所有人同意不得將文件中的內(nèi)容挪作商業(yè)或盈利用途。
  • 5. 眾賞文庫僅提供信息存儲空間,僅對用戶上傳內(nèi)容的表現(xiàn)方式做保護處理,對用戶上傳分享的文檔內(nèi)容本身不做任何修改或編輯,并不能對任何下載內(nèi)容負責。
  • 6. 下載文件中如有侵權或不適當內(nèi)容,請與我們聯(lián)系,我們立即糾正。
  • 7. 本站不保證下載資源的準確性、安全性和完整性, 同時也不承擔用戶因使用這些下載資源對自己和他人造成任何形式的傷害或損失。

最新文檔

評論

0/150

提交評論