在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中利用蛋白組學(xué)技術(shù)探究miR-45新的直接作用靶點(diǎn)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤(glioma)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的腫瘤，且其發(fā)病率隨年齡增大有增高的趨勢(shì)，具有侵襲性生長(zhǎng)，無(wú)控性增殖，易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)。傳統(tǒng)的治療方法包括手術(shù)、化療和放療，治療效果差，不能明顯的提高患者的生存率。特別是Ⅲ級(jí)（WHO分級(jí)）間變性膠質(zhì)瘤和Ⅳ級(jí)（WHO分級(jí)）膠質(zhì)母細(xì)胞瘤，因其高增殖及侵襲性生物學(xué)特性，雖經(jīng)手術(shù)為主的聯(lián)合放射及化學(xué)治療，預(yù)后并沒(méi)有得到明顯改善，其平均生存時(shí)間分別僅為1.5年和9-12個(gè)月。膠質(zhì)瘤本質(zhì)上是一種多基因異常疾病

2、，通常伴有原癌基因的過(guò)表達(dá)和抑癌基因的突變?nèi)笔?，因此，在基因水平探討膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制，從根本上糾正與膠質(zhì)瘤發(fā)生，發(fā)展相關(guān)的基因異常，探索基因治療方法已成為醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。
　　 miRNA是一類長(zhǎng)約19-24nt的非編碼RNA，能夠與靶基因的3'端非編碼區(qū)(3' UTR)結(jié)合而抑制靶mRNA的翻譯或使其降解，對(duì)基因表達(dá)起到轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用。microRNA通過(guò)調(diào)控復(fù)雜的細(xì)胞信號(hào)通路網(wǎng)絡(luò)和對(duì)細(xì)胞的多方面生物學(xué)行為影響，直接

3、或者間接參與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展。microRNA和腫瘤之間的密切聯(lián)系已經(jīng)成為醫(yī)學(xué)科學(xué)研究領(lǐng)域的另一熱點(diǎn)。近年來(lái)越來(lái)越多研究發(fā)現(xiàn)microRNA的異常表達(dá)與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系。miR-21的高表達(dá)可以促進(jìn)U251膠質(zhì)細(xì)胞瘤的侵襲性生長(zhǎng)，miRNA-128直接結(jié)合于Bmi-1mRNA的3'非編碼區(qū)的一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)，抑制Bmi-1致癌基因表達(dá)，抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖。
　　 MiR-451位于染色體17q11.2，與原癌基因人類

4、表皮生長(zhǎng)因子受體2的17q11.2-21區(qū)域臨近。近年來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)異常表達(dá)的miR-451與腫瘤的發(fā)生，發(fā)展有密切的關(guān)系。Gal等研究表明miR-451在惡性膠質(zhì)瘤干細(xì)胞中低表達(dá)，miR-451聯(lián)合抗腫瘤藥甲磺酸伊馬替尼能明顯抑制膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖。在胃癌和結(jié)腸直腸癌中miR-451低表達(dá)，并且通過(guò)直接靶標(biāo)癌基因巨噬細(xì)胞遷移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）發(fā)揮抑癌因

5、子的作用，miR-451高表達(dá)時(shí)能降低細(xì)胞的增值能力，增加細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，而低表達(dá)時(shí)與患者較差的預(yù)后密切相關(guān)。miR-451還可以通過(guò)抑制c-myc的表達(dá)明顯抑制結(jié)腸癌細(xì)胞系SW620裸鼠皮下種植瘤的生長(zhǎng)。另外，近年來(lái)亦有研究發(fā)現(xiàn)miRNA-451與腫瘤的耐藥性有密切的關(guān)系。miR-451可能通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖，上調(diào)bax蛋白及下調(diào)p-Akt(Ser473)、bcl-2蛋白表達(dá)而逆轉(zhuǎn) A549/DDP細(xì)胞對(duì)DDP的耐藥性

6、，在乳腺癌多藥耐藥細(xì)胞系MCF-7/DOX中，過(guò)表達(dá)miR-451通過(guò)直接調(diào)控耐藥基因MDR1的表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)阿霉素的敏感性。也有研究報(bào)道稱卵巢癌多藥耐藥的癌細(xì)胞系A(chǔ)2780DX5和KB-V1中抑制miR-451或miR-27a的表達(dá)可導(dǎo)致MDR1的mRNA和蛋白水平的下降，從而增加細(xì)胞系對(duì)藥物（長(zhǎng)春堿、阿霉素）的敏感程度。
　　 本課題組在預(yù)實(shí)驗(yàn)研究中通過(guò)miRNA微陣列芯片雜交發(fā)現(xiàn):6個(gè)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-451表達(dá)下調(diào)

7、為正常腦組織的50％以下，miR-451在膠質(zhì)瘤中作為抑癌因子可以明顯抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(LN229，U87和U251)的增殖，轉(zhuǎn)移，侵襲，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。本課題組并對(duì)miR-451的作用機(jī)制進(jìn)行了研究，通過(guò)生物學(xué)信息預(yù)測(cè)，western blot和熒光素酶等試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)CAB39為miR-451的直接作用靶點(diǎn)，miR-451有可能通過(guò)直接靶標(biāo)CAB39調(diào)控PI3K/AKT信號(hào)通路進(jìn)而發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用。為進(jìn)一步研

8、究miR-451的作用機(jī)制，尋找miR-451的直接作用靶點(diǎn)至關(guān)重要，以期為膠質(zhì)瘤的臨床治療提供新的思路，本課題首先利用蛋白組學(xué)從整體上研究miR-451對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87基因的表達(dá)的影響并結(jié)合生物學(xué)信息預(yù)測(cè)軟件miranda，預(yù)測(cè)出miR-451可能的直接作用靶點(diǎn)，然后再利用western blot和熒光素酶實(shí)驗(yàn)對(duì)預(yù)測(cè)出的可能的直接靶點(diǎn)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。
　　 本課題研究分為以下三部分:
　　 第一部分、將膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U

9、87分成兩組:未作任何處理的為對(duì)照組，應(yīng)用寡核苷酸miR-451 mimics轉(zhuǎn)染的為處理組，培養(yǎng)24小時(shí)之后提RNA利用Real-time PCR檢測(cè)miR-451的表達(dá)，利用iTRAQ試劑標(biāo)記的蛋白組學(xué)技術(shù)整體上研究miR-451對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U87基因表達(dá)的影響并結(jié)合microRNA的靶點(diǎn)預(yù)測(cè)軟件miranda預(yù)測(cè)miR-451的可能的作用靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，處理組基因表達(dá)差異≥1.5倍的有261種，其中143種基因表達(dá)

10、是降低的，118種基因表達(dá)是升高的，261種差異蛋白中結(jié)合miranda軟件預(yù)測(cè)出18種miR-451可能的直接作用靶點(diǎn)，包括10種表達(dá)降低的基因和8種表達(dá)升高的基因。
　　 第二部分、蛋白組學(xué)結(jié)合miranda軟件預(yù)測(cè)的miR-451的可能的靶點(diǎn)中包括YWHAE基因，有文獻(xiàn)報(bào)道YWHAE基因在乳腺癌，原發(fā)性肝癌和結(jié)腸癌中為促癌基因。本實(shí)驗(yàn)利用膠質(zhì)瘤組織芯片的免疫組織化學(xué)技術(shù)和westem blot技術(shù)，探究YWHAE基因在膠質(zhì)

11、瘤組織和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中的表達(dá)。結(jié)果顯示，YWHAE基因的表達(dá)(14-3-3ε)在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)Ⅲ和Ⅳ級(jí)）中明顯高于低級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)Ⅰ和Ⅱ級(jí)），并且膠質(zhì)瘤組織的YWHAE的表達(dá)明顯高于正常組織。與對(duì)照細(xì)胞系GES-1相比，膠質(zhì)瘤細(xì)胞系(LN229，U87和U251)中YWHAE的表達(dá)明顯增高。
　　 第三部分、miR-451對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（LN229，U87和U251）YWHAE表達(dá)的影響。本實(shí)驗(yàn)將膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（

12、LN229，U87和U251）分成三組，未作任何處理的為對(duì)照組，轉(zhuǎn)染無(wú)義序列的為scamble組和轉(zhuǎn)染miR-451 mimics的為處理組。利用Real-time PCR檢測(cè)miR-451的轉(zhuǎn)染效率以及miR-451在mRNA水平對(duì)YEHAE基因表達(dá)的影響，利用western blot檢測(cè)miR-451對(duì)YWHAE基因表達(dá)的影響，利用雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證YWHAE基因是否為miR-451的直接作用靶點(diǎn)。結(jié)果顯示，miR-451可以明

13、顯抑制YWHAE基因的表達(dá)，但是在mRNA水平對(duì)YWHAE的表達(dá)無(wú)顯著影響，熒光素酶實(shí)驗(yàn)顯示較control組、scramble組及pEZX-MT01-YWHAE-3'UTR-Mut組相比，共轉(zhuǎn)染has-miR-451 mimics和pEZX-MT01-YWHAE-3'UTR-wild質(zhì)粒組相對(duì)熒光強(qiáng)度顯著降低(P＜0.01)。故可推斷YWHAE是miR-451直接作用靶基因。
　　 結(jié)論:
　　 1、通過(guò)蛋白組學(xué)，本課

14、題組成功預(yù)測(cè)出18種miR-451的可能的直接作用基因，其中包括YWHAE基因。
　　 2、與正常組織相比，YWHAE基因在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)，并且在高級(jí)別膠質(zhì)瘤（WHO分級(jí)）組織中的表達(dá)高于低階別膠質(zhì)瘤。與對(duì)照細(xì)胞系GES-1相比，YWHAE基因在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中亦是高表達(dá)的。
　　 3、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系（LN229，U87和U251）中miR-451可以明顯抑制YWHAE基因的表達(dá)，但是在mRNA水平對(duì)YWHAE基因的表