基于蛋白組學(xué)的miR-101的調(diào)控環(huán)路與靶點(diǎn)研究.pdf_第1頁
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1、第一部分miR-101的雙向負(fù)反饋環(huán)路
  目的:研究肝癌細(xì)胞中miR-101與EZH2之間的相互調(diào)控作用。方法:通過基因功能獲得與失活策略,研究miR-101與EZH2在mRNA及蛋白水平上的相互關(guān)系。利用miRNA前體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn),證實(shí)miR-101/EZH2調(diào)控環(huán)路的效用并確定miR-101/EZH2調(diào)控環(huán)路的參與者。利用定量基因組PCR,研究miR-101缺失與miR-101前體誘導(dǎo)效率之間的關(guān)系。利用集落形成實(shí)驗(yàn),遷移/侵襲

2、實(shí)驗(yàn)、劃痕實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)升高miR-101后對(duì)肝癌細(xì)胞遷移及增殖能力的抑制作用。結(jié)果:升高miR-101可以降低EZH2的表達(dá)水平,而EZH2的表達(dá)升高可以抑制miR-101的表達(dá)。miR-101前體誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),成熟miR-101只能誘導(dǎo)pre-mir-101-1的表達(dá)而對(duì)pre-mir-101-2的誘導(dǎo)作用不明顯。HepG2與SMMC-7721細(xì)胞中,miR-101前體誘導(dǎo)效率的不同,與細(xì)胞中miR-101位點(diǎn)缺失程度有關(guān)。升高miR-1

3、01可以明顯抑制肝癌細(xì)胞遷移及增殖能力。結(jié)論:在肝癌細(xì)胞中,miR-101與EZH2是以雙向負(fù)反饋環(huán)路的形式進(jìn)行相互調(diào)控的。干預(yù)這一環(huán)路對(duì)肝癌有抑制作用。
  第二部分利用雙向電泳檢測(cè)miRNA調(diào)控靶點(diǎn)的技術(shù)建構(gòu)
  目的:構(gòu)建可用于miRNA靶點(diǎn)發(fā)現(xiàn)的雙向電泳體系。方法:利用慢病毒過表達(dá)載體,構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-101的肝癌細(xì)胞系。通過雙向電泳技術(shù),分析過表達(dá)miR-101細(xì)胞系與空載體細(xì)胞系蛋白質(zhì)譜的變化,從而實(shí)現(xiàn)miR

4、-101調(diào)控靶點(diǎn)的鑒定。結(jié)果:利用24㎝pH3~10非線性固相pH梯度干膠條,在10%的PAGE膠上可以分離到600個(gè)左右的蛋白質(zhì)點(diǎn),組內(nèi)重復(fù)性較好,蛋白點(diǎn)匹配率達(dá)到99%以上。組間差異較大的蛋白質(zhì)點(diǎn)20個(gè)左右。結(jié)論:利用雙向電泳技術(shù),可以同時(shí)發(fā)現(xiàn)諸多microRNA調(diào)控靶點(diǎn)。這為microRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的研究提供了一個(gè)新的思路。
  第三部分miR-101調(diào)控靶點(diǎn)的質(zhì)譜鑒定與分析
  目的:利用高效色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)鑒定mi

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