親和組合分組系統(tǒng)的研究及在蛋白組學中應用.pdf

1、細胞中含有成千上萬種不同分子量、相對豐度、酸堿性和疏水性分布范圍很寬的各種結構或功能蛋白，用現(xiàn)有儀器手段分析如此復雜的生物樣品，就需要一個有效的方法分離、簡化復雜的組織蛋白樣品，提高質譜對蛋白的檢出率。本論文開發(fā)了一套基于親和層析的組合分組系統(tǒng)對組織樣品進行簡化分組，分組后分別進行trypsin蛋白酶消化和LC-MS/MS分析，分組后通過質譜分析能夠鑒定出更多的蛋白信息。本論文開發(fā)出串聯(lián)親和與級聯(lián)親和兩種親和組合分組系統(tǒng)，并應用于大鼠肝

2、細胞溶質和小鼠睪丸蛋白組學研究中。
　　 將不同的氨基酸、小肽或氨基化合物連接到Sepharose固相基質上構建了本實驗室小分子化學配體庫，這些親和配體的結構差異導致了不同的蛋白-配體非鍵相互作用，從而能夠特異親和吸附不同的蛋白組。分析不同親和配體的蛋白結合圖譜，找出蛋白條帶分布差異明顯、吸附性能適中的親和配體，如果這些差異親和配體的吸附蛋白圖譜的條帶疊加能夠覆蓋原始樣品電泳圖譜的全蛋白譜，就可以作為親和組合分組系統(tǒng)的備選配體。

3、本論文篩選到的主要差異親和配體為:A1-4、A6、A7-56、A8-54、A11-70、A15、A17-56、A25-35、A29-32和A84。
　　 大鼠肝細胞溶質組織勻漿蛋白(Fraction0)通過A7-56、A84、A11-70、A6、A29-32五柱串聯(lián)親和組合系統(tǒng)分配后得到5個吸附組分(Fraction1～Fraction5)和1個流穿組分(Fraction6)。通過LC-MS/MS分析，F(xiàn)raction0中鑒定出

4、371個非冗余的可信蛋白組（1450個特異多肽），而6個串聯(lián)親和組分Fraction1～Fraction6中分別鑒定出289、123、152、279、154和60個非冗余的可信蛋白組。統(tǒng)計合并剔除重復部分后，6個串聯(lián)親和分配亞組分中總共鑒定得到665個非冗余的可信蛋白組(2413個特異多肽)，是串聯(lián)親和分組前蛋白鑒定數(shù)目的1.8倍。665個大鼠肝鑒定蛋白中，430個蛋白只出現(xiàn)在特異的某一組分中而不與其他組分重疊，比例高達64.7％，這充

5、分展示了串聯(lián)親和分組系統(tǒng)中各親和配體蛋白吸附特性的差異，通過這些差異配體的串聯(lián)組合實現(xiàn)了復雜樣品的簡化分組。對鑒定蛋白的生物信息分析發(fā)現(xiàn)，串聯(lián)親和分組系統(tǒng)對各種極端特性蛋白都有較好的敏感性，665個鑒定蛋白中有61個極端尺寸蛋白(MW＜10kD，or＞100kD)，14個極端等電點蛋白(pI＜4.3，or＞10)，55個疏水蛋白（GRAVY正值）和41個膜蛋白。
　　 大鼠肝細胞溶質組分(F0)通過A15～A8-54～A11-7

6、0三級聯(lián)親和分組系統(tǒng):第一級分配得到F1-1和F1-2兩個組分，第二級得到F2-1～F2-4四個組分，第三級得到F3-1～F3-8八個組分。LC-MS/MS分析，F(xiàn)0中鑒定得到391個非冗余的可信蛋白組，F(xiàn)1-1和F1-2中鑒定出499個蛋白組（提高27.6％），F(xiàn)2-1～F2-4中鑒定出616個蛋白組（相比第一級提高了23.4％），F(xiàn)3-1～F3-8中鑒定出738個蛋白組（相比第二級提高了19.8％）。大鼠肝細胞溶質通過三級聯(lián)親和分組

7、系統(tǒng)總共鑒定出859個非冗余的可信蛋白組，是未分組前鑒定蛋白數(shù)目的2.2倍。鑒定的859個大鼠肝蛋白中，有75個分子量＜20kDa的蛋白，73個分子量＞100kDa蛋白，72個疏水蛋白和49個膜蛋白。
　　 以成熟的A15～A8-54～A11-70三級聯(lián)親和分組系統(tǒng)對小鼠睪丸蛋白組學進行了研究，級聯(lián)親和分組后的8個組分中共鑒定得到1378個非冗余的可信蛋白組，是分組前鑒定蛋白數(shù)目的2.6倍，是文獻報道的2-DE-MS方法鑒定的最

8、大小鼠睪丸蛋白數(shù)目的2.7倍。1378個鑒定蛋白中，尺寸最小的是只有817Da的小肽，最大的高達630.35kDa,12個蛋白分子量＜10kDa,169個蛋白分子量＞100kDa,38個蛋白pI＜4.5,51個蛋白pI＞10，有93個疏水蛋白和81個膜蛋白，這都超出了現(xiàn)有小鼠睪丸蛋白組學研究中獲得極端特性蛋白的極限。我們還對所有鑒定蛋白的亞細胞器定位和蛋白功能定義進行了歸類分析，其中有310個蛋白(22.5％)亞細胞器定位信息未知，22

9、1個蛋白在Uniprot數(shù)據庫沒有GO分子功能定義，分析找出了16個與生精及精子發(fā)育相關的蛋白。
　　 我們的研究結果表明:串聯(lián)和級聯(lián)兩種親和組合系統(tǒng)都能夠快速實現(xiàn)對復雜組織樣品的預分組，分組后大大提高了質譜分析的蛋白檢出率。親和組合分組系統(tǒng)相比2-DE和2D-LC分配方法具備無可比擬的優(yōu)越性:簡單快速（可以節(jié)省至少2/3時間），親和配體容易制備、穩(wěn)定性好（耐酸、堿和高壓處理），不需要特別高昂的設備，對不同組織樣品可以采用標準化