新型交聯(lián)酶聚體技術(shù)及其在蛋白組學與生物催化中的應(yīng)用.pdf

1、本文針對交聯(lián)酶聚體(Cross-linked enzyme aggregates，CLEAs)在制備及應(yīng)用上的兩類缺陷，即制備過程中沉淀步驟酶活損失大，催化大分子底物反應(yīng)時傳質(zhì)限制嚴重，分別提出了糖類添加劑改善CLEAs酶活及多孔化CLEAs改性兩種制備新方法，并將其應(yīng)用于分析化學與生物催化領(lǐng)域的三個體系，即蛋白組學分析中的胰蛋白酶酶解過程、青霉素?；该阜ê铣砂⒛髁帧⒛竟系鞍酌该阜ń到鈿ぞ厶侵苹钚缘途厶?，具體結(jié)果如下：
　　

2、 1.采用90％濃度乙醇為沉淀劑，0.075％戊二醛為交聯(lián)劑，以傳統(tǒng)方法制備得到了酶活收率為44％的胰蛋白酶CLEAs：胰蛋白酶CLEAs的最適催化溫度(70℃)、最適催化pH(9.0)、熱穩(wěn)定性和儲存穩(wěn)定性，均較游離酶有所提高；CLEAs“腳手架”狀微觀形貌決定了其優(yōu)良的穩(wěn)定性和高催化活性。
　　 2.將胰蛋白酶CLEAs用于蛋白組學的酶解肽譜分析中，有效防止了高酶濃度下胰蛋白酶的自水解；同時結(jié)合高溫輔助酶解、超聲輔助酶解可實

3、現(xiàn)高通量肽譜解析，分別縮短酶解時間至60min和60s，顯著提高了分析通量和序列覆蓋度。
　　 3.針對傳統(tǒng)青霉素?；窩LEAs制備過程中沉淀步驟酶活損失大的缺陷，設(shè)計了在有機沉淀步驟加入糖類添加劑以提高最終CLEAs酶活的新技術(shù)，得到酶活收率為79.3％的青霉素?；窩LEAs，比傳統(tǒng)制備工藝酶活提高30％；揭示了糖類添加劑(如海藻糖)以“水替代”方式與酶蛋白結(jié)合，起到維持酶蛋白天然結(jié)構(gòu)，保持CLEAs活性的作用機理。

4、>　　 4.將糖類添加劑改善的青霉素?；窩LEAs應(yīng)用于抗生素阿莫西林的酶法合成反應(yīng)中，考察了CLEAs對阿莫西林合成收率和選擇性的影響；引入30％甲醇介質(zhì)體系并在高底物比條件下反應(yīng)，阿莫西林收率可達57％。
　　 5.針對傳統(tǒng)方式制備的木瓜蛋白酶CLEAs在催化大分子底物反應(yīng)時效率低的問題，提出以淀粉為致孔劑，在CLEAs內(nèi)部形成孔隙結(jié)構(gòu)，制成多孔化CLEAs(p-CLEAs)的改進技術(shù)；將p-CLEAs應(yīng)用于大分子蛋白底