NRCF動態(tài)蛋白組學(xué)測定、生物信息學(xué)分析及其功能的初步實驗研究.pdf

1、周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injuries，PNI)，是一類高發(fā)生率、高致殘性的常見創(chuàng)傷，其發(fā)生的常見原因為意外傷害、疾病或者需要分離周圍神經(jīng)到達(dá)毗鄰手術(shù)部位的外科操作等。對周圍神經(jīng)損傷處理不當(dāng)，可引起其部分或全部功能喪失，影響患者生活質(zhì)量，甚至造成患者殘疾，給社會造成巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。
　　臨床工作中，周圍神經(jīng)損傷最常用的處理方法為斷端直接縫合法和自體神經(jīng)移植術(shù)。但因神經(jīng)功能束的錯位、吻合口瘢痕等，療效難以進(jìn)

2、一步提高，并可造成供區(qū)的繼發(fā)性損傷。因此，周圍神經(jīng)擬生態(tài)結(jié)構(gòu)再生成為了機(jī)理研究的重要方向，也是對周圍神經(jīng)再生研究的新思路。研究表明，周圍神經(jīng)再生依賴于具備自我調(diào)控、自我完善機(jī)制的微環(huán)境。目前，基于神經(jīng)再生室(nerveregeneration chambers，NRC)修復(fù)為核心的，綜合應(yīng)用功能細(xì)胞植入及基因治療等多種措施的生物學(xué)治療方法，取得了突破性進(jìn)展，是周圍神經(jīng)再生研究的方向。
　　20世紀(jì)80年代，LundborgG和他的

3、合作者采用了圓筒狀NRC模型成功修復(fù)了大鼠周圍神經(jīng)的離斷缺損，從而成為研究周圍神經(jīng)損傷的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。此后，研究者對LundborgG NRC模型的管腔材料、管腔內(nèi)容物、可溶性調(diào)節(jié)成分和功能細(xì)胞等進(jìn)行了相關(guān)研究。NRC模型所提供的封閉微環(huán)境是研究周圍神經(jīng)再生的重要窗口。而神經(jīng)再生條件液(nerve regeneration conditioned fluid，NRCF)是NRC模型中自神經(jīng)斷端分泌的功能性液體，其來源于周圍神經(jīng)的組成細(xì)胞

4、，或經(jīng)軸突順向轉(zhuǎn)運(yùn)、逆向彌散而來的物質(zhì)成分，主要組成為蛋白，其在周圍神經(jīng)再生不同時期的表達(dá)存在種類和數(shù)量的動態(tài)變化。研究表明，NRCF對再生神經(jīng)提供支持、營養(yǎng)和導(dǎo)向等重要作用。
　　周圍神經(jīng)損傷的修復(fù)是一個復(fù)雜的、精細(xì)的生理過程。周圍神經(jīng)功能性再生取決于特定微環(huán)境和神經(jīng)元自身生長能力的共同作用。相對于激活神經(jīng)元自身生長能力是其固有特性方面，對損傷所處的特定微環(huán)境研究就更為重要。神經(jīng)再生室模型(NRC)所提供的封閉微環(huán)境作為研究周圍

5、神經(jīng)再生的重要窗口，而神經(jīng)再生條件液(NRCF)是NRC中的功能性成分，對其進(jìn)行研究將是揭示周圍神經(jīng)再生機(jī)理的重要途徑。但目前，對周圍神經(jīng)再生的微環(huán)境因素，如細(xì)胞外基質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)因子和細(xì)胞因子等，進(jìn)行了大量研究，但都是隨機(jī)的、散在的和推測的。因此，對NRCF中蛋白成分譜的描繪，可為研究微環(huán)境在周圍神經(jīng)再生中的作用提供直接依據(jù)，對闡明再生機(jī)制具有重要指導(dǎo)意義。而蛋白組學(xué)技術(shù)的發(fā)展為此提供了研究的方法基礎(chǔ)。相對和絕對定量的等量異位標(biāo)簽(is

6、obaric tags for relative and absolute quantitation, iTRAQ)技術(shù)是目前先進(jìn)的蛋白組學(xué)技術(shù)，可同時比較4種或8種不同樣品中蛋白質(zhì)的相對含量或絕對含量，w為目前研究NRCF中整體蛋白成分和時間差異表達(dá)的有效方式。
　　鑒于微環(huán)境在周圍神經(jīng)損傷修復(fù)中的重要作用，對其功能性成分(NRCF)進(jìn)行研究將是了解周圍神經(jīng)再生機(jī)理的重要途徑。本課題首次采用iTRAQ技術(shù)對周圍神經(jīng)再生四個關(guān)鍵時

7、間點(神經(jīng)離斷3d，7d，14d和25d) NRCF的蛋白成分做了整體的、全景的動態(tài)呈現(xiàn)和分析，通過比對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，對共表達(dá)蛋白進(jìn)行了生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了某些關(guān)鍵蛋白和周圍神經(jīng)再生的關(guān)系。通過實驗初步探討了NRCF對雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響。并結(jié)合前期研究成果，討論了NRCF中不同補(bǔ)體成分參與周圍神經(jīng)再生過程的動態(tài)變化及其意義。
　　第一部分:NRC模型的建立、NRCF的提取及對雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響
　

8、　目的：
　　典型的神經(jīng)再生室(NRC）模型為連接神經(jīng)兩斷端的圓筒狀硅膠或其他材質(zhì)所形成的密閉的間隙，其所提供的封閉微環(huán)境是研究周圍神經(jīng)再生的重要窗口，而神經(jīng)再生條件液(NRCF)是NRC模型中自神經(jīng)斷端分泌的功能性成分，可對再生神經(jīng)提供支持、營養(yǎng)和導(dǎo)向作用。雪旺細(xì)胞(schwann cell，Sc)及成纖維細(xì)胞（fibroblast cell，F(xiàn)b）是參與周圍神經(jīng)再生的主要功能細(xì)胞。本部分實驗采用Lewis大鼠坐骨神經(jīng)(scia

9、tic nerve)建立NRC模型，提取NRCF，并采用CCK-8法及流式細(xì)胞儀檢測，探討NRCF對雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　方法：
　　Lewis大鼠坐骨神經(jīng)10mm離斷缺損，采用特定規(guī)格硅膠管體內(nèi)建立NRC模型、7d時提取NRCF。BCA法進(jìn)行NRCF蛋白濃度測定。雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞細(xì)胞株的傳代培養(yǎng)。CCK-8法和流式細(xì)胞術(shù)檢測NRCF對雪旺細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　結(jié)果：
　　NRCF

10、為清澈、淡黃色、呈類血清樣并稍粘稠的液體，濃度為15.01μg/μl。雪旺細(xì)胞呈類圓形或梭形胞體，部分有兩個或兩個以上的突起，而成纖維細(xì)胞細(xì)胞體較大，呈棱形、長條狀或不規(guī)則三角形，融合后為編織狀，細(xì)胞核一般呈長橢圓形。NRCF能顯著促進(jìn)雪旺細(xì)胞(Sc)、成纖維細(xì)胞(Fb)的增殖，并且此作用呈時間、濃度依賴性，促進(jìn)該兩種細(xì)胞增殖的有效濃度為10000ng/ml。
　　結(jié)論：
　　1.采用Lewis大鼠坐骨神經(jīng)建立NRC模型，模

11、型穩(wěn)定、可靠，提取NRCF質(zhì)量能很好滿足實驗要求。Lewis Rat Sciatic Nerve-NRC模型是研究周圍神經(jīng)再生的有效途徑。
　　2.采用CCK-8法及流式細(xì)胞儀檢測技術(shù)，初步證明神經(jīng)再生條件液(NRCF)具有促進(jìn)雪旺細(xì)胞及成纖維細(xì)胞增殖的生物活性。
　　第二部分 NRCF-i TRAQ蛋白組學(xué)研究和生物信息學(xué)分析
　　目的：
　　神經(jīng)再生條件液(NRCF)是NRC中神經(jīng)斷端分泌的功能性成分，主要為

12、蛋白成分，對NRCF中的蛋白成分進(jìn)行研究將為揭示周圍神經(jīng)再生機(jī)理提供一個平臺。本部分實驗采用iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，以周圍神經(jīng)再生四個關(guān)鍵時間點（坐骨神經(jīng)離斷3d，7d，14d和25d）所提取的NRCF為研究對象，對NRCF每個時間點、全部時間點及其各個時間點之間的蛋白定性和定量表達(dá)情況進(jìn)行分析，并通過比對蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，對共表達(dá)蛋白進(jìn)行了進(jìn)一步的生物學(xué)信息分析。
　　方法：
　　建立NRC模型、提取3d，7d，

13、14d和25d NRCF材料及其NRCF樣品處理。SDS-PAGE電泳。iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)、質(zhì)譜鑒定。GO分析、KEGG通路分析、分層聚類分析、共趨勢分析、時序表達(dá)的基因篩選等生物信息學(xué)分析方法對NRCF蛋白進(jìn)行定性、定量分析。
　　結(jié)果：
　　3d，7d，14d和25d NRCF4組樣品蛋白質(zhì)條帶分布較均一，平行度良好。3d，7d，14d和25d神經(jīng)再生條件液(NRCF)中共鑒定出876個蛋白，其中，3d，7d，14d

14、和25d神經(jīng)再生條件液(NRCF)中蛋白個數(shù)分別為:536、645、376和548個，其獨特蛋白質(zhì)個數(shù)分別為:95、137、18和58個，共同蛋白質(zhì)個數(shù)為264個。
　　共表達(dá)蛋白定量生物信息學(xué)分析顯示:KEGG Pathway所得到的TOP10通路為:補(bǔ)體及凝血級聯(lián)、金黃色葡萄球菌感染、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、百日咳、粘著斑、朊病毒、阿米巴病、肌動蛋白骨架調(diào)節(jié)、糖酵解/糖異生、ECM受體作用等。共趨勢分析第2組、第3組和第4組TOP7蛋

15、白分別為PROFILIN-1、DESTRIN-LIKE、 ACTIN-RELATED PROTEIN2/3 COMPLEX SUBUNIT2、ANNEXIN A1、CORONIN-1A、PROTEIN S100-A8和PROTEIN S100-A9等;CLUSTERIN、 EPIDERMAL GROWTH FACTOR RECEPTOR、RETINOL-BINDING PROTEIN4、COLLAGEN ALPHA-2(I) CHAIN

16、、 HIGH MOBILITYGROUP PROTEIN B2-LIKE、 LIVER CARBOXYLESTERASE1和COMPLEMENT FACTOR I等;EUKARYOTIC TRANSLATION ELONGATIONFACTOR1 ALPHA2、HEMOGLOBIN SUBUNIT ALPHA-1/2、 HEMOGLOBINALPHA2 CHAIN、 SUPEROXIDE DISMUTASE[CU-ZN].、 GALEC

17、TIN-5、ISOFORM2 OF GROWTH FACTOR RECEPTOR-BOUND PROTEIN2和CARBONIC ANHYDRASE2等。顯著差異蛋白和高連接度信息蛋白為GRB2、ACTB、ALB、VIM、VCP、A2M、CALR、THBS1、TF和PEBP1等。
　　結(jié)論：
　　1.采用iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)，對周圍神經(jīng)再生的四個關(guān)鍵時間點的NRCF蛋白進(jìn)行了全景的、動態(tài)的分析，建立了一個相對完

18、整的NRCF蛋白數(shù)據(jù)庫。NRCF蛋白含量豐富，種類繁多，每個關(guān)鍵時間點既有特異蛋白，各個關(guān)鍵時間點也有共同蛋白，與周圍神經(jīng)再生不同階段關(guān)系密切。
　　2.數(shù)據(jù)分析篩選出周圍神經(jīng)再生的不同關(guān)鍵時間點的特異蛋白、共趨勢分析篩選出的不同組別的高表達(dá)蛋白和時序表達(dá)的基因篩選所獲得的顯著表達(dá)蛋白等，為尋找影響周圍神經(jīng)再生的關(guān)鍵蛋白提供了依據(jù)。這些數(shù)據(jù)，不僅，豐富了對周圍神經(jīng)再生的認(rèn)識，而且，為將來神經(jīng)再生課題提供了眾多的基因和蛋白研究靶點。

19、
　　3.NRCF蛋白的全景揭示和相關(guān)文獻(xiàn)復(fù)習(xí)，對既往神經(jīng)再生所取得的研究成果也進(jìn)行了部分驗證，并為深入研究再生理論開辟了新的途徑。
　　第三部分 NRCF中補(bǔ)體成分及與周圍神經(jīng)再生關(guān)系
　　目的：
　　NRCF蛋白譜提示，補(bǔ)體系統(tǒng)成分的大量存在，并在不同神經(jīng)再生時期具有明顯的動態(tài)變化。生物學(xué)分析（KEGG通路分析）表明補(bǔ)體通路位居前十個顯著富集通路。補(bǔ)體系統(tǒng)在周圍神經(jīng)再生過程中所起的作用非常值得研究。補(bǔ)體系統(tǒng)（

20、幾種或一種關(guān)鍵成分）所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)、炎癥反應(yīng)，甚至與兩者無關(guān)，但與神經(jīng)再生相關(guān)的作用于PNI中亟待揭示。本部分將對NRCF-iTRAQ蛋白組學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)的大量補(bǔ)體成分及其動態(tài)變化加以描述、分析和總結(jié)，并采用Westernblot技術(shù)對NRCF中部分補(bǔ)體成分加以驗證，對其可能參與周圍神經(jīng)再生的作用機(jī)制加以探討。
　　方法：
　　建立NRC模型、提取7dNRCF及其NRCF樣品處理。iTRAQ蛋白組學(xué)技術(shù)相關(guān)方法（同第二部分）。

21、Western blot實驗技術(shù)檢測C1q、C3、C7和CFD在NRCF中的表達(dá)。
　　結(jié)果
　　NRCF-iTRAQ蛋白組學(xué)分析所得10種補(bǔ)體成分分別為CFI、C1q-A、C1q-B、C2、C3、C4、C5、C7、C8β和CFD等。Western blot證實NRCF中有C1q、 C3、C7和CFD的表達(dá)。
　　結(jié)論：
　　NRCF中有10余種補(bǔ)體成分定性和定量信息的存在，補(bǔ)體C7在再生不同時間階段量化分析有顯