神經(jīng)上皮干細胞與雪旺細胞聯(lián)合培養(yǎng)中相互影響的實驗研究.pdf

1、背景： 雪旺細胞(Schwann cell，SCs)是周圍神經(jīng)的主要結(jié)構(gòu)和功能細胞，神經(jīng)損傷后它對神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)起著重要的作用，是比較公認的種子細胞。然而SCs存在不足，如：自體來源的SCs在適當條件下難以獲得大量的雪旺細胞，多次傳代后其形態(tài)和功能改變，且需二次手術(shù)；而異體來源的SCs則存在免疫排斥反應(yīng)等，因此有必要繼續(xù)尋找更為有效的種子細胞。神經(jīng)干細胞移植入缺損的周圍神經(jīng)后能夠向雪旺細胞分化，改善神經(jīng)再生的微環(huán)境，促進周

2、圍神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，而神經(jīng)干細胞分化形成神經(jīng)元并發(fā)出軸突支配受損神經(jīng)的靶器官能防止靶器官萎縮，揭示了神經(jīng)干細胞在修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的廣闊前景。神經(jīng)上皮干細胞是較原始的神經(jīng)干細胞，有巨大的神經(jīng)元方向分化潛能，更適合修復(fù)損傷的神經(jīng)通路。關(guān)于雪旺細胞對神經(jīng)干細胞存活分化的影響已有初步研究，但雪旺細胞對神經(jīng)上皮干細胞的影響以及雪旺細胞與神經(jīng)上皮干細胞之間相互影響的結(jié)果鮮有報道。 目的： 周圍神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)問題一直是創(chuàng)傷外科

3、和神經(jīng)科學(xué)關(guān)注的問題。雪旺細胞作為首選的種子細胞在應(yīng)用上存在不足而受到限制。而神經(jīng)干細胞修復(fù)周圍神經(jīng)損傷存在巨大的潛能，分化成特定的神經(jīng)細胞以及類雪旺細胞樣細胞后分泌細胞因子以及其他一些不明機制均促進神經(jīng)再生。所以探索如何為損傷的周圍神經(jīng)提供有利的環(huán)境，如何獲得足夠量的雪旺細胞，如何促進NSC的存活和增加向SCs或神經(jīng)元分化的數(shù)量，促進周圍神經(jīng)再生和功能恢復(fù)，以期為有效修復(fù)周圍神經(jīng)功能提供依據(jù)。在上述思想指導(dǎo)下，我們設(shè)計了本項實驗：應(yīng)用

4、神經(jīng)上干細胞與雪旺細胞體外共培養(yǎng)的方法，觀察神經(jīng)上皮干細胞存活、定向分化、雪旺細胞增殖及MBP表達的情況，旨在探求體外培養(yǎng)同時獲得足夠量雪旺細胞和較多神經(jīng)元的最佳條件，為細胞移植修復(fù)周圍神經(jīng)損傷提供體外實驗依據(jù)。 方法： 本課題從新生Wistar大鼠坐骨神經(jīng)及臂叢神經(jīng)分離雪旺細胞，用含10﹪胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液于5﹪CO<,2>、37°C、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、純化，備用；從孕11.5d Wistar大鼠的胚胎神經(jīng)

5、管分離神經(jīng)上皮干細胞，用含10ng/mlbFGF和1xB27的DMEM/F12無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)備用。通過雪旺細胞與神經(jīng)上皮干細胞聯(lián)合培養(yǎng)，培養(yǎng)液分別為無血清的DMEM/F12(1：1)，1﹪血清的DMEM/F12(1：1)，5﹪血清的．DMEM/F12(1：1)，10﹪血清的DMEM/F12(1：1)，每2d更換新鮮培養(yǎng)液，并分別將收集更換的上清液過濾作為條件培養(yǎng)液，-70℃保存。實驗組培養(yǎng)液分別為收集到的0、1、5、10﹪血清條件培養(yǎng)

6、液；對照組為0、1、5、10﹪血清DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)液。 1．定時于倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細胞的形態(tài)，并用顯微攝像系統(tǒng)采集圖像記錄。 2．實驗組神經(jīng)上皮干細胞接種于置有預(yù)涂多聚賴氨酸的蓋玻片的24孔板中，不同血清濃度的條件培養(yǎng)液培養(yǎng)，每2～3d換液，培養(yǎng)1周；對照組將神經(jīng)上皮干細胞接種于預(yù)涂多聚賴氨酸的蓋玻片上，用DMEM/F12(1：1)培養(yǎng)1周；取出蓋玻片，固定，MAP-2、GFAP免疫熒光染色。每組選取4張蓋

7、玻片，每片隨機取5個不同的視野，IPP圖像分析軟件計數(shù)同一視野中神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞，統(tǒng)計分析各組神經(jīng)元及星形膠質(zhì)細胞的比例。 3．雪旺細胞以10<'5>個/ml接種于多聚賴氨酸包被過的96孔板中，每孔100ul，各組分別設(shè)8個復(fù)孔，培養(yǎng)3d，每孔加入MTT溶液(5mg/ml)15μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后吸掉上清，用DMSO溶解結(jié)晶。然后將培養(yǎng)板放在Multiskan MK3酶標儀上，采用實驗波長570nm，測定每孔OD值。

8、 4．雪旺細胞與神經(jīng)上皮干細胞聯(lián)合培養(yǎng)4周后提取細胞總蛋白，通過SDS—PAGE及Western-blot檢測MBP表達情況；對照組為單獨培養(yǎng)的雪旺細胞，陽性對照為成熟的周圍神經(jīng)組織。部分標本細胞免疫化學(xué)檢測雪旺細胞MBP的表達。 結(jié)果： 1．神經(jīng)上皮干細胞懸浮生長，并分裂增殖形成由十幾個細胞組成的神經(jīng)球，隨著培養(yǎng)時間的延長，神經(jīng)球中細胞數(shù)目不斷增加，第5～6d可生長成大約幾十個細胞組成的神經(jīng)球。免疫細胞化學(xué)染色：球體n

9、estin染色陽性，球周圍有MAP2、GFAP染色陽性細胞。 剛接種的原代Schwann細胞呈圓形，懸浮在培養(yǎng)液中，接種后6h大部分細胞貼壁，其中大部分細胞開始呈橢圓形，24h后變成雙極，胞體飽滿，立體感強，少數(shù)呈三角形，伸出三個突起。培養(yǎng)48～72h后，出現(xiàn)聚合現(xiàn)象，許多細胞聚合在一起呈端對端、肩并肩、漩渦狀或柵欄狀排列，在細胞密度較低時，則聚集成堆，形成"細胞島"，免疫細胞化學(xué)染色為S-100陽性；另一種細胞稍大，外形不規(guī)則

10、，呈扁平狀，突起短而多，核較淺，為成纖維細胞，所占比例較低。 實驗組中神經(jīng)球貼壁較快，培養(yǎng)24h可見大部分神經(jīng)球貼壁，培養(yǎng)36h可見自神經(jīng)球遷出細胞，細胞形態(tài)大多圓形，胞體較飽滿，突起細長的神經(jīng)元可見二三級突起，大體形態(tài)與成熟神經(jīng)元相似。神經(jīng)球周圍有細短突起伸出，隨著培養(yǎng)時間延長，突起束狀排列，雪旺細胞早期形態(tài)無明顯變化，隨著神經(jīng)球中遷出的細胞增多，明場下可觀察到在神經(jīng)元的軸突局部呈雙軌樣結(jié)構(gòu)，也有少數(shù)多個突起的細胞胞體呈不規(guī)則

11、型。對照組中的神經(jīng)球較少貼壁，且貼壁后的神經(jīng)球周圍遷出的細胞極少，生長狀況較差，且隨培養(yǎng)時間延長神經(jīng)球貼壁不牢，其周圍的細胞也逐漸減少，至培養(yǎng)1周，幾乎無貼壁的神經(jīng)球和細胞。 2.通過細胞免疫熒光染色和圖像分析觀察到實驗組神經(jīng)元與星形膠質(zhì)細胞比例為1.53：1，神經(jīng)元形態(tài)成熟。隨著血清濃度增加，神經(jīng)元比逐漸降低。 3.MTT實驗結(jié)果顯示：實驗組及對照組中隨血清濃度提高，雪旺細胞存活及增殖率顯著增加；0﹪血清實驗組較0﹪血

12、清對照組更能促進雪旺細胞存活和增殖，而其余血清濃度對照組促存活增殖效果優(yōu)于實驗組(P<0.01)。 4.細胞免疫化學(xué)顯示MBP：部分軸突局部出現(xiàn)陽性表達MBP，表明雪旺細胞能夠在神經(jīng)上皮干細胞分化形成的神經(jīng)元的誘導(dǎo)下向成髓鞘雪旺細胞方向分化5.Westernb-lot顯示：單獨培養(yǎng)的雪旺細胞中未見表達，聯(lián)合培養(yǎng)的細胞裂解后的上清液中有MBP存在，成熟的神經(jīng)組織中MBP含量較多。 結(jié)論： 聯(lián)合培養(yǎng)既有利于神經(jīng)上皮干