去細胞同種異體神經(jīng)種植雪旺細胞的體外實驗觀察.pdf

1、目的：雪旺細胞和基底膜管在周圍神經(jīng)損傷后的神經(jīng)修復性再生中起著非常重要的作用。雪旺細胞作為神經(jīng)纖維內(nèi)主要的非神經(jīng)元活性細胞，具有神經(jīng)營養(yǎng)、趨化和使再生纖維成熟等重要功能?；啄す軇t能形成神經(jīng)再生的支架性三維空間從而起到接觸引導的作用。 由于胎兒組織尚未具有明顯的生物學特性，免疫系統(tǒng)處于不成熟狀態(tài)，對寄生環(huán)境有強烈依賴性，因此排斥反應發(fā)生不明顯，容易導致“免疫寬容”。胎齡為28天的胎兔周圍神經(jīng)系統(tǒng)已經(jīng)發(fā)育成熟。因此，采用胎兔周圍神

2、經(jīng)培養(yǎng)雪旺細胞，既避免了自體雪旺細胞來源受限及自體神經(jīng)二次損傷又可避免細胞移植后產(chǎn)生的免疫反應。已有的實驗表明，最近發(fā)展的化學萃取方法可有效清除神經(jīng)中的雪旺細胞及髓鞘，從而減輕異體神經(jīng)的抗原性。而且，經(jīng)過化學萃取的異體神經(jīng)在去除抗原成分的同時還可保留其完整的纖維支架結構和完整的基底膜。去細胞技術的發(fā)展為臨床尋找理想的自體神經(jīng)移植替代物開辟了新的途徑。 本實驗通過將胎兔雪旺細胞與經(jīng)去細胞處理的同種異體神經(jīng)橋接體經(jīng)體外結合培養(yǎng)，觀察

3、胎兔雪旺細胞在橋接體中的生長情況并討論將胎兔雪旺細胞植入去細胞同種異體神經(jīng)橋接體制備組織工程化人工神經(jīng)修復周圍神經(jīng)缺損的可行性。為含雪旺細胞的去細胞同種異體神經(jīng)橋接復合體的體內(nèi)移植提供指導。 方法： 1.細胞培養(yǎng)：取懷孕28天的新西蘭白兔，耳緣靜脈注射空氣處死后迅速取胎兔。在手術顯微鏡下無菌條件下取胎兔坐骨神經(jīng)，盡量剝除神經(jīng)外膜及束膜。Hank's液沖洗5遍后將神經(jīng)剪碎。使用雙酶消化法(trypsin/collagena

4、se)培養(yǎng)雪旺細胞，培養(yǎng)過程中利用雙差速貼壁法及Arab-C(終末濃度10-5mmol/l)去除和抑制成纖維細胞后使用NGF(40ng/ml)促進SC生長。每日在倒置顯微鏡下觀察細胞的生長情況； 2.去細胞神經(jīng)橋接體制備：取成年健康新西蘭白兔一只，分別自梨狀肌下緣水平以遠切取雙側坐骨神經(jīng)，作為異體神經(jīng)的來源。神經(jīng)萃取前先在手術顯微鏡下去除表面的脂肪組織及部分神經(jīng)外膜，然后先置4℃蒸餾水中靜置6h，再將神經(jīng)段放入3％TritonX

5、-100中靜置12h，然后置蒸餾水中震蕩漂洗6h。如此反復，TritonX-100共作用時間為96h。對萃取的神經(jīng)段行石蠟切片HE染色，Laminin(層粘連蛋白)免疫組化染色及掃描電鏡觀察去細胞的情況； 3.雪旺細胞的植入：將培養(yǎng)好的原代SC以107/L的濃度用100ul的微量注射器注入去細胞神經(jīng)段中央，注射后置于細胞培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。分別與培養(yǎng)的1、3、5天通過石蠟切片HE染色觀察SC在橋接體中的生長情況。 結論：采

6、用雙差速貼壁法去除絕大部分成纖維細胞后在細胞培養(yǎng)的初期使用Arab-C抑制成纖維細胞生長，后期培養(yǎng)液中加入NGF促進雪旺細胞生長能獲取大量雪旺細胞且純度可達90％以上。用3％TritonX-100作用96h可去除周圍神經(jīng)中的細胞和髓鞘而保留完整的神經(jīng)基底膜管和纖維支架結構，并且對神經(jīng)基底膜主要成分-層粘連蛋白無明顯影響。采用胎兔坐骨神經(jīng)培養(yǎng)的雪旺細胞能在用成年兔坐骨神經(jīng)制備的去細胞橋神經(jīng)接體中生長良好，并且有遷移成行的特性。種植胎兒雪旺