同種異體NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤RPMI 8226細(xì)胞殺傷活性的體外研究.pdf

1、背景與目的:多發(fā)性骨髓瘤(multiple myeloma，MM)是漿細(xì)胞惡性增生性疾病，約占血液惡性腫瘤的10％。單藥用于難治性MM效果欠佳，大多數(shù)單藥化療的有效率非常低。聯(lián)合化療以及新的藥物如沙利度胺和硼替佐米的使用仍達(dá)不到理想的療效。自體造血干細(xì)胞移植雖可使部分患者病情緩解，但費(fèi)用高，最終疾病仍要復(fù)發(fā)。異基因造血干細(xì)胞移植是治愈MM的根本手段，但因患者年齡較大、緩解率低、缺乏HLA相合的供者，移植相關(guān)病死率高，限制了它的應(yīng)用。由于

2、上述原因，到目前為止，MM仍被認(rèn)為是不可治愈的疾病。因此，臨床需要尋找治療骨髓瘤的新方法。自體干細(xì)胞移植后輸注KIR(抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體inhibitory killer cell immunoglobulin-like receptor，KIR)-錯(cuò)配的異基因自然殺傷細(xì)胞(Allo-reactive Natural Killer，Allo-NK)作為新的生物治療方法可以清除殘留的腫瘤細(xì)胞，避免移植后疾病復(fù)發(fā)，延長(zhǎng)生存期。<

3、br>　　 在異基因造血干細(xì)胞移植中，同種異體反應(yīng)性自然殺傷細(xì)胞有提高白血病治愈率的作用。最近研究顯示，Allo-NK細(xì)胞對(duì)原代的胃癌、惡性黑色素瘤、腎癌、腸癌和卵巢癌細(xì)胞也有殺傷作用。但是，Allo-NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤細(xì)胞的作用尚待研究。
　　 NK細(xì)胞是遺傳性免疫系統(tǒng)的主要效應(yīng)細(xì)胞，對(duì)病原感染的或變異的細(xì)胞具有自然細(xì)胞毒效應(yīng)，NK細(xì)胞表面表達(dá)的受體與靶細(xì)胞表面的配體通過遺傳模式識(shí)別發(fā)揮效應(yīng)。NK細(xì)胞對(duì)靶細(xì)胞的殺傷活性與其細(xì)胞

4、表面的受體和靶細(xì)胞表面的配體密切相關(guān)。NK細(xì)胞表面的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(inhibitorykiller cell immunoglobulin-like receptor，KIR)與靶細(xì)胞表面特定的HLA-Ⅰ類分子結(jié)合，介導(dǎo)對(duì)NK細(xì)胞毒活性的抑制效應(yīng)，靶細(xì)胞缺乏KIR特定的配體將激發(fā)NK細(xì)胞對(duì)其殺傷活性。NKG2D是NK細(xì)胞表面的主要活化性受體；其配體為MHC-Ⅰ類鏈相關(guān)分子A或B(MHC class I chain-re

5、lated molecule A or B，MICA/B)及人巨細(xì)胞病毒UL16蛋白的結(jié)合蛋白(human cytomegalovirus glycoprotein UL16binding proteins，ULBPs: ULBP1、ULBP2、ULBP3)，NKG2D和腫瘤細(xì)胞表面的相應(yīng)配體結(jié)合，介導(dǎo)NK細(xì)胞的殺傷效應(yīng)。異基因造血干細(xì)胞移植中，當(dāng)存在供者到受者方向的抑制性殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體.配體錯(cuò)配時(shí)，供者的同種反應(yīng)性NK細(xì)胞介

6、導(dǎo)的抗白血病效應(yīng)可以防止白血病復(fù)發(fā)。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)NK細(xì)胞能抑制慢性粒細(xì)胞白血病患者白血病CD34+細(xì)胞形成粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落形成單位，表明NK細(xì)胞對(duì)白血病細(xì)胞和白血病克隆形成細(xì)胞具有殺傷效應(yīng)。有研究證實(shí)，KIR-配體錯(cuò)配的NK細(xì)胞可有效地殺傷原代的胃癌、腎癌、腸癌、卵巢癌腫瘤細(xì)胞，而無KIR-配體錯(cuò)配的NK細(xì)胞不具有殺傷活性。
　　 依據(jù)骨髓瘤的起源、病因、發(fā)病機(jī)理、生物學(xué)行為和對(duì)NK細(xì)胞功能的揭示，本研究以人骨髓瘤RPMI82

7、26細(xì)胞和Allo-NK細(xì)胞混合培養(yǎng)為反應(yīng)體系，以對(duì)NK細(xì)胞殺傷活性高敏感性的K562細(xì)胞做對(duì)照來探討：①Allo-NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的殺傷活性；②其相關(guān)分子基礎(chǔ)是什么；③能否通過調(diào)節(jié)，提高RPMI8226細(xì)胞對(duì)Allo-NK細(xì)胞的殺傷敏感性。本研究旨在尋找新的骨髓瘤牛物治療方法，并其提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　 方法:
　　 第一部分人骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的生物學(xué)特性
　　 觀察光鏡下RP

8、MI8226細(xì)胞形態(tài)、生長(zhǎng)特點(diǎn)，體外克隆形成率；流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞周期分布、多藥耐藥蛋白P.170及ABCG2的表達(dá)。
　　 第二部分 NK細(xì)胞對(duì)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞的體外殺傷活性
　　 免疫磁珠法分離純化5例健康者的NK細(xì)胞，體外IL2培養(yǎng)24h，作為效應(yīng)細(xì)胞。以體外培養(yǎng)的K562和RPMI8226細(xì)胞為靶細(xì)胞，LDH釋放法檢測(cè)不同效靶比時(shí)5例健康者的NK細(xì)胞對(duì)其的殺傷活性，確定20:1為最佳效靶比，進(jìn)一步觀察2

9、0:1時(shí)NK細(xì)胞對(duì)K562和RPMI8226細(xì)胞體外克隆形成的影響。
　　 第三部分骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞體外逃逸NK細(xì)胞免疫殺傷機(jī)制的初步研究
　　 以QIAampDNA抽提試劑提取RPMI8226細(xì)胞和健康志愿者的NK細(xì)胞的DNA； PCR-SSP法測(cè)定健康志愿者NK細(xì)胞KIR基因型。采用序列特異性引物擴(kuò)增法分析RPMI8226細(xì)胞HLA Ⅰ類分子基因型(sequence specific primer
　

10、　 polymerase chain reproduction，PCR-SSP)。RT-PCR檢測(cè)K562和RPMI8226細(xì)胞NKG2D配體基因的表達(dá)情況，流式細(xì)胞儀檢測(cè)其細(xì)胞表面HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)情況。流式細(xì)胞儀及細(xì)胞免疫組化法檢測(cè)K562和RPMI8226細(xì)胞表面NKG2D配體的表達(dá)情況。觀察效靶比20:1時(shí)阻斷不同的NKG2D配體及HLA-Ⅰ類分子NK細(xì)胞對(duì)K562和RPMI8226細(xì)胞殺傷活性的影響。
　　 第四

11、部分提高骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性
　　 以熱療、三氧化二砷、硼替佐米處理的RPMI8226細(xì)胞為靶細(xì)胞，觀察效靶比20:1時(shí)RPMI8226細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞殺傷敏感性的變化，流式細(xì)胞儀檢測(cè)處理后RPMI8226細(xì)胞表面NKG2D配體和HLA-Ⅰ類分子的表達(dá)情況。
　　 結(jié)論:
　　 1、RPMI8226細(xì)胞是惡性細(xì)胞。
　　 2、RPMI8226細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷具有低敏感性。

12、>　　 3、RPMI8226細(xì)胞對(duì)NK細(xì)胞的殺傷敏感性低與其表面低表達(dá)NKG2D配體和高表達(dá)HLA-Ⅰ類分子有關(guān)。
　　 4、NK細(xì)胞對(duì)RPMI8226細(xì)胞的殺傷是受HLA-KIR和NKG2D-NKG2DL雙信號(hào)調(diào)節(jié)的。
　　 5、熱療和低劑量三氧化二砷可以提高NK細(xì)胞對(duì)RPMI8226細(xì)胞的殺傷敏感性。
　　 6、熱療和低劑量三氧化二砷是通過提高RPMI8226細(xì)胞表面的NKG2D配體表達(dá)而使NK細(xì)胞的殺傷活