南瓜蛋白對(duì)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞作用和Notch信號(hào)通路相關(guān)機(jī)制探討.pdf

1、目的：應(yīng)用高效、低毒的天然活性藥物南瓜蛋白(Cucurmosin,CUS)對(duì)骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞體外增殖作用實(shí)驗(yàn)、凋亡檢測(cè)及Notch相關(guān)信號(hào)通路的研究，初步探討CUS對(duì)RPMI8226增殖、凋亡等機(jī)制，為CUS治療MM提供理論依據(jù)。
　　方法：采用MTT法檢測(cè)CUS對(duì)體外培養(yǎng)的RPMI8226細(xì)胞增殖抑制作用（量效和實(shí)效）；胎盤(pán)藍(lán)拒染法計(jì)數(shù)活細(xì)胞繪制生長(zhǎng)曲線，測(cè)定CUS對(duì)RPMI8226細(xì)胞增殖能力的影響；集落增殖抑制試驗(yàn)

2、測(cè)定CUS對(duì)PRMI8226細(xì)胞的體外增殖抑制作用；透射電鏡觀察CUS作用后的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)；Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡；PI單染流式細(xì)胞術(shù)DNA倍體分析；Western blot檢測(cè)CUS作用PRMI8226細(xì)胞后凋亡相關(guān)蛋白bcl-2和casepase-3、casepase-8、casepase-9等表達(dá)水平的變化及Notch信號(hào)通路相關(guān)信號(hào)Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB表達(dá)水平的變化。

3、
　　結(jié)果：1.MTT比色法結(jié)果顯示：不同劑量CUS（0、0.0078、0.0156、0.0625、0.125、2.0umol/L）作用RPMI8226細(xì)胞不同時(shí)間（24h、48h、72h）后增殖抑制率從7.0％提高到86.4%，其24h、48h、72h的IC50分別為80umol/L，0.65umol/L，0.2umol/L。呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。各時(shí)段CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.01）。2.生長(zhǎng)曲線結(jié)果表明：C

4、US藥物處理組的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)明顯不如對(duì)照組，隨著藥物濃度的增加，細(xì)胞數(shù)明顯減少，其生長(zhǎng)緩慢的潛伏期延長(zhǎng)，對(duì)數(shù)期曲線的斜率趨于平緩。不同劑量CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。3.集落增殖抑制試驗(yàn)表明：不同劑量CUS(0.0078、0.0156、0.0312、0.0625、0.125、0.25umol/L)作用RPMI8226細(xì)胞7天后集落形成率由50.5%減少到5%，集落抑制率由18.5%提高到91.9%。不同劑量CU

5、S干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。4.透射電鏡觀察到：與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞體積變小、皺縮，細(xì)胞核明顯減小且不規(guī)則，核質(zhì)比減小，核呈現(xiàn)分葉、破碎及邊集等凋亡現(xiàn)象，核內(nèi)異染色質(zhì)增多，染色質(zhì)固縮、濃集，出現(xiàn)典型的凋亡改變，并有凋亡小體(Apoptosis body)形成。5.Annexin V/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)凋亡率呈量效關(guān)系逐漸增加，不同濃度CUS（0、0.125、0.5和2umol/L）各組的凋亡率分別為：7.4

6、4、12.49、17.48和26.41％。PI單染流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示也同樣呈明顯的濃度依賴(lài)性，DNA倍體分析呈現(xiàn)典型的亞G1(sub-G1)凋亡峰，不同濃度CUS（0、0.0078、0.0312、0.125、0.25umol/L）作用72h后的凋亡率分別為0、4.2、10.8、30.6和42.2％，呈劑量依賴(lài)性。不同劑量CUS干預(yù)組與陰性組比較有顯著性差異（P<0.05）。6.Western blot結(jié)果顯示：CUS作用RPMI8226

7、細(xì)胞72h后，bcl-2表達(dá)水平明顯下調(diào)，而caspase-3和caspase-8、caspase-9則表達(dá)顯著上調(diào)，呈明顯的時(shí)間和濃度依賴(lài)性。同時(shí)有關(guān)Notch信號(hào)通路Notch1、Jagged-2、P-Akt和Nf-kB也以時(shí)間和濃度依賴(lài)的方式表達(dá)下調(diào)。
　　結(jié)論：1.CUS對(duì)體外培養(yǎng)的RPMI8226細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用，并呈時(shí)間-劑量依性。2.CUS能有效誘導(dǎo)多發(fā)性骨髓瘤RPMI8226細(xì)胞凋亡，并在一定濃度范圍內(nèi)呈