大鼠雪旺細胞與成骨細胞聯(lián)合培養(yǎng)構(gòu)建神經(jīng)化組織工程骨的前期研究.pdf

1、目的：
　　 1．體外原代培養(yǎng)SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)、GFP轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細胞(GFP-BMSCs)、成骨細胞(osteoblasts，OB)、雪旺細胞(Schwann cells，SCs)、感覺神經(jīng)元(dorsal rootganglion，DRG)、交感神經(jīng)元(superior cervical ganglion，SCG)細胞。觀察DRG

2、、SCG、SCs對GFP-BMSCs分化的成骨細胞增殖的影響。SCs對BMSCs分化OB及顱骨來源OB增殖的影響及機制研究。
　　 2．研究采用熒光微球655（Quantum dot655， QD655）標記大鼠BMSCs體外可行性研究。探討此染料對大鼠BMSCs的毒性、增殖、成骨分化、動態(tài)標記率等功能，為體內(nèi)示蹤研究打下研究基礎(chǔ)。
　　 3．研究膠原-生物活性玻璃材料的生物相容性研究，包括溶血試驗，浸提液對RSC96細

3、胞株增殖試驗，膠原-生物活性玻璃干濕態(tài)下力學強度研究，最佳接種液體量研究，最佳接種方式方式研究、BMSCs與SCs粘附于材料增殖研究，材料對細胞促增殖試驗及向成骨促分化試驗，以及初步體內(nèi)皮下包埋驗證成骨試驗。
　　 4．探討采用克氏針與快速成型技術(shù)制成接骨板固定大鼠8mm骨缺損穩(wěn)定性研究，采用體內(nèi)軸向壓縮生物力學測試及體內(nèi)動態(tài)觀察固定失效率進行試驗，探求兩種固定方式的方法、手術(shù)技巧、優(yōu)點及缺點，探求合適固定大鼠骨缺損固定方式。<

4、br>　　 5．探討采用大鼠隱動靜脈及隱神經(jīng)束作為神經(jīng)血管束移植作為外源性因素同步構(gòu)建神經(jīng)血管化組織工程骨的可行性，以及采用熒光微球標記的SCs與GFP轉(zhuǎn)染的成骨細胞聯(lián)合負載于膠原-生物活性玻璃體內(nèi)示蹤可行性研究。
　　 方法：
　　 1．以2周齡SD大鼠為試驗動物模型，采用股骨、脛骨骨髓沖洗法收集細胞，以培養(yǎng)的第3代BMSCs用于試驗；采用1d齡乳鼠2只，采用75％酒精浸泡15min，無菌取出顱骨，采用無菌眼科剪建成

5、1-2mm3碎片。向剪碎的骨組織中加入1mL0.25%的胰蛋白酶37℃，消化90min，稍離，去上清。加入0.2%Ⅰ型膠原酶3-5mL，37℃，連續(xù)消化2次60min。中止消化，收集細胞，重復上述試驗，收集細胞，計數(shù)后，種植于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后換液，以后每2～3d換液1次。達到80%～90%融合時(原代培養(yǎng)3～5d)，消化傳代，分組培養(yǎng)，采用堿性磷酸酶染色進行鑒定，2-5代用于試驗；采

6、用15d孕鼠，無菌取出胎鼠，取背根神經(jīng)節(jié)，0.25%胰酶消化50min，種植到預先鋪板的蓋玻片上，進行感覺神經(jīng)元培養(yǎng)；采用1d齡乳鼠，取頸上神經(jīng)節(jié)，0.25%胰酶消化30min，種植到預先鋪板的培養(yǎng)板；取1d乳鼠，取出坐骨神經(jīng)及臂叢神經(jīng)，采用組織塊貼壁法獲得SCs。采用P3BMSCs向成骨誘導分化2周，進行鑒定；分別采用SCs、DRG、SCG與顱骨來源成骨細胞和BMSCs來源成骨細胞共培養(yǎng)檢測，檢測共培養(yǎng)后成骨細胞增殖及分化機制。

7、>　　 2．采用QD655按照試劑盒推薦濃度，分別將QD試劑A和試劑載體B各取1μL混置于1.5mL微量離心管中，放于孵育15min，加入100μL培養(yǎng)基，渦旋30s，向管中加入含106個P3細胞的0.2mL懸液，打勻后置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h，用完全培養(yǎng)基漂洗兩遍后，在熒光顯微鏡下檢測。根據(jù)QD試劑推薦濃度標記第3代細胞(P3)為試驗組，以未用QD標記的細胞作為空白對照組。用苔盼藍拒染法檢測標記后細胞存活率，用MT

8、T法觀察染料對細胞增殖性的影響，采用茜素紅、堿性磷酸酶染色、real-time PCR鑒定對成骨分化的影響；分別在標記后即刻、1w、2w、4w、6w利用熒光顯微鏡計數(shù)檢測兩組標記時間和陽性率；并用電鏡觀察標記后細胞在材料的貼附性。
　　 3．華南理工大學材料學院提供膠原-生物活性玻璃，提取材料浸提液，實施溶血試驗、細胞增殖試驗，將細胞粘附材料分別于1d、3d、5d、7d進行對比電鏡觀察，并將SCs負載與膠原-生物活性玻璃上，采用

9、電鏡觀察材料對SCs貼壁情況；采用膠原-生物活性玻璃在干濕態(tài)下，對濕態(tài)下膠原材料進行力學強度對比；取6塊6×8mm2，采用微量注射器，每20μL液體量滴加材料，直至材料地面有液體滲出為止，統(tǒng)計注射液體量，計算最佳加液量；采用5點注射，分別于材料表面0mm、2mm、4mm進行梯度注射尋求最佳注射位點；取P3代BMSCs接種于材料及24孔板中，其中一部分材料采用SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，一部分材料采用成骨誘導，分別于與之相同培養(yǎng)基

10、的細胞進行對比，2w后采用real-time PCR進行檢測，檢測成骨分化程度。取P3BMSCs向成骨分化2周，種植在膠原-生物活性玻璃上，切成1ml薄片皮下包埋裸鼠背部，將觀察材料有誘導成骨性能。
　　 4．采用快速成型技術(shù)，自行設(shè)計塑料接骨板，材料為進口無毒材料。制備SD大鼠股骨8mm骨缺損。共采用12只350-500g大鼠處死，取出股骨進行接骨板固定與克氏針髓內(nèi)固定，測試軸向生物力學強度，檢測兩種固定方式軸向抗壓縮能力；取

11、24只350-500g大鼠隨機分為A組與B組，A組采用接骨板固定，B組采用克氏針固定。分別于術(shù)后2w、4w、8w進行X線片，評價固定缺損穩(wěn)定狀況，總結(jié)兩組失敗率及類型，總結(jié)適合大鼠最佳固定方式。
　　 5．采用9只150-200g SD大鼠，暴露并游離隱動靜脈隱神經(jīng)束，移植于預先處理的膠原-生物活性玻璃，于術(shù)后3d、7d、14d采用冰凍切片進行HE染色觀察血管網(wǎng)形成；采用GFP轉(zhuǎn)染BMSCs向體外誘導成骨2周，采用Qtracke

12、r655標記大鼠SCs接種于膠原-生物活性玻璃上，移植于大鼠8mm骨缺損體內(nèi)1周后取出采用共聚焦觀察兩種細胞示蹤可行性。
　　 結(jié)果：
　　 1．原代SD大鼠BMSCs、OB、DRG、SCG、SCs培養(yǎng)成功，DRG于共培養(yǎng)5d時，對成骨細胞較空白對照組有明顯的促增殖作用，有顯著性差異(相應F=0.802，P=0.007)而與其他對照組及無明顯差別，SCG各個時間段對顱骨來源成骨細胞較對照組均無促增殖作用(P＞0.05)。

13、采用96孔共培養(yǎng)板，共培養(yǎng)1d、3d、5d無統(tǒng)計學差異，共培養(yǎng)7d、9d兩個時間段SCs對成骨細胞有明顯的促增殖作用，較對照組均有顯著性差異(P＜o．05)。SCs對BMSCs來源OB在共培養(yǎng)1、3d兩組沒有統(tǒng)計學差異，余下3個時間段均有統(tǒng)計學差異，試驗組由于對照組。SCs在3d、5d、7d對成骨細胞作用在ALP、OPN、OCN、BMP-2、CollamRNA較未共培養(yǎng)的成骨細胞均低表達，表明SCs對成骨細胞起抑制分化作用。而對BMSC

14、s來源成骨細胞，在ALP、OPN、OCN、BMP-2、CollamRNA在3d是均有高表達，ALP、Colla在第7d呈低表達，提示SCs在成骨誘導培養(yǎng)環(huán)境中對BMSCs來源的成骨細胞起到促分化作用。
　　 2．試驗組與對照組細胞存活率均＞90%，比較差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)；培養(yǎng)1、3、5、7、9d兩組增殖率比較差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0，05）。標記的BMSCs經(jīng)誘導分化2周后，茜素紅及ALP染色均呈陽性，實時熒光定

15、量PCR檢測經(jīng)標記的BMSCs的OPNmRNA、BglapmRNA、Colla1mRNA、Alp1mRNA、Bmp2mRNA較對照組均呈高表達。熒光顯微鏡下胞漿呈紅色熒光，標記后即可標記率可達96.5±1.59%，隨著標記時間的增加，標記率下降，分別為1w93.30±1.51%、2w72.40±2.90%、4w40.10±3.60%、6w10.00±1.70%，對照組各時間點標記陽性率均為0；掃描電鏡觀察標記后細胞和材料貼附良好。

16、>　　 3．采用膠原-生物活性玻璃材料中，采用支架材料浸提液，對兔靜脈血沒有產(chǎn)生溶血作用，對RSC96增殖較對照組在各個時間段均無抑制作用；采用軸向壓縮測試力學強度，證實濕態(tài)下支架材料的強度高于膠原組織，而明顯低于干性支架材料；采用逐漸加液體的方法，探討出最佳加液量為0.88ml/cm3；采用五點梯度為2mm為最佳注射方法，可將細胞均勻種植到材料上；材料對BMSCs起到抑制分化作用；膠原-生物活性玻璃負載成骨細胞包埋裸鼠體內(nèi)可以形成骨

17、質(zhì)，構(gòu)建的組織工程骨具在BMP-2、OPN、CollamRNA較正常骨高表達，提示組織工程骨處于快速成骨期。
　　 4．克氏針髓內(nèi)固定及接骨板固定兩種方式手術(shù)技巧討論，克氏針固定較接骨板固定更為方便，所需要時間更短，兩者存在顯著性差異(P＜0.05)。并術(shù)后2、4、8w進行X線片統(tǒng)計固定失效率，并在體外進行軸向壓縮生物力學檢測。探討最佳固定方式。發(fā)現(xiàn)在體外生物力學強度測試中，接骨板軸向壓縮所受力為40.38±4.04，克氏針壓縮

18、失效值所受力為29.53±2.95，克氏針徹底失效值所受力為58.49±5.85，三組間均有統(tǒng)計學差異(P＜0.05)。在動態(tài)X線片觀察中發(fā)現(xiàn)，克氏針組出現(xiàn)失敗率為91.67%(11/12)，接骨板失敗率為16.67%(2/12)。本部分研究得出在大鼠股骨骨缺損中，應采用接骨板固定更為理想。
　　 5．在大鼠模型中可采用隱動脈、隱靜脈、隱神經(jīng)束作為整體血管神經(jīng)束移植構(gòu)建血管神經(jīng)化組織工程骨，HE染色鑒定材料有較多血管形成，并隨時

19、間遞增血管分布密度增加?？刹捎寐《綠FP轉(zhuǎn)染BMSCs以及QD655標記SCs種植到膠原-生物活性玻璃進行體內(nèi)示蹤。證實隱動脈、靜脈、神經(jīng)束可以作為整體進行移植，在材料內(nèi)可以形成較多血管組織。在共聚焦顯微鏡下可以對兩種細胞進行示蹤，并在一周的X線片中可以發(fā)現(xiàn)有成骨形成。
　　 結(jié)論：
　　 1．DRG可能對成骨細胞起到促增殖作用；SCG對成骨細胞不起到促增殖作用；SCs對成骨細胞起到明顯的促增殖作用；SCs對顱骨來源的

20、成骨細胞起到抑制分化作用；對骨髓間充質(zhì)干細胞來源的成骨細胞起到促進分化作用。
　　 2．Qtraker655對大鼠BMSCs標記時間長，標記率及安全性高，并不改變細胞的成骨性能，是一種良好標記物。
　　 3．膠原-生物活性玻璃是一種生物相容性好，可構(gòu)建骨組織的支架材料。
　　 4．在大鼠股骨骨缺損固定中，接骨板效果優(yōu)于克氏針髓內(nèi)固定。
　　 5．在大鼠構(gòu)建神經(jīng)血管化組織工程，隱動靜脈隱神經(jīng)束可作為外源性因