恥骨聯合軟骨細胞作為組織工程種子細胞的實驗研究.pdf

1、恥骨間盤與關節(jié)盤都是纖維軟骨組織，從恥骨聯合的軟骨組織中是否能夠分離獲取有活性的細胞、在體外培養(yǎng)、與支架材料復合生長、并在體內異位形成軟骨組織，是其能否作為構建組織工程化關節(jié)盤種子細胞供體，所必須要首先探討的問題。 本實驗對恥骨聯合及其分離的細胞進行系列研究，探討恥骨聯合軟骨細胞是否能夠作為組織工程種子細胞，為進一步的組織工程構建關節(jié)盤做準備。 本實驗共分為三個部分： 實驗一：恥骨聯合軟骨的形態(tài)學研究 通

2、過對取自SD大鼠的恥骨聯合軟骨組織行HE染色、阿爾辛蘭染色和Ⅱ型膠原免疫組化染色，觀察到恥骨聯合軟骨組織中有大量平行和交叉排列的纖維束，軟骨細胞較小，胞漿嗜堿性著色，呈圓形、卵圓形或短梭形，位于陷窩內，分布于纖維束之間，多為成對存在，或排列成行。細胞及軟骨陷窩附近阿爾辛蘭染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色著色深，而細胞外間質部分著色較淺。通過對骨盆標本的測量，發(fā)現成年男性的恥骨聯合軟骨為一個前部較厚、后部較薄的楔形片狀組織，軟骨組織量約為1.1

3、3cm3。 實驗二：恥骨聯合軟骨細胞體外培養(yǎng)及細胞學研究 觀察從恥骨聯合軟骨組織中分離的細胞，在體外培養(yǎng)過程中的表型、生長增殖情況。結果表明：經膠原酶分別消化2、6、12h后，平均每100mg恥骨聯合軟骨在不同消化時間獲取的原代細胞數之間有統(tǒng)計學顯著差異(P＜0.01)。消化6小時組可以獲取約(3.03±0.208)×106細胞，生長狀態(tài)好。細胞漿內質網發(fā)達，線粒體較豐富。第1代細胞阿爾辛蘭染色、Ⅱ型膠原免疫細胞化學染色

4、均呈陽性。Ⅱ型膠原免疫組化染色在第4代細胞仍呈陽性，而在第7代呈陰性。第1、4代細胞PDT分別為55.5h、56.9h，第7代細胞中梭形、肥大的細胞增多，生長增殖速度明顯減弱，PDT為134.2h。 實驗三：恥骨聯合軟骨細胞與支架復合培養(yǎng)的實驗研究 按5×107個細胞每毫升藻酸鈉溶液混合，制備細胞藻酸鹽凝膠復合物，觀察細胞在復合物中的活性，再將細胞凝膠復合物植入裸鼠背部皮下，觀察在體內異位形成軟骨組織的情況。結果見，細胞

5、分散懸浮在凝膠支架中，細胞存活率為72.4％±4.5％，保持一定的增殖能力，并可逐漸增殖形成細胞團塊。細胞支架復合物在植入體內6周和12周時，經阿爾辛蘭染色及Ⅱ型膠原免疫組化染色證實，形成了軟骨島樣結構。 結論：恥骨聯合軟骨組織體積較大，可以提供較多的軟骨組織用來分離細胞。從SD大鼠恥骨聯合軟骨分離獲取的細胞具有較強的適應性和增殖能力，可以在體外進行原代和傳代培養(yǎng)。單層培養(yǎng)條件下，第4代及以前的細胞保留了軟骨細胞的基本表型特征，