絲素-膠原蛋白支架聯(lián)合雪旺細(xì)胞及脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)缺損的研究.pdf

1、目的：
　　組織工程化神經(jīng)作為自體神經(jīng)移植的有效替代物，被廣泛用于橋接神經(jīng)缺損及引導(dǎo)神經(jīng)生長(zhǎng)的研究。組織工程化神經(jīng)和自體神經(jīng)移植的最大區(qū)別在于它們所處的再生微環(huán)境不同。如果提供一個(gè)理想的再生微環(huán)境，組織工程化神經(jīng)對(duì)周圍神經(jīng)的缺損修復(fù)還很切實(shí)可行的。本研究為了最大程度上地模擬機(jī)體再生微環(huán)境，我們選擇共培養(yǎng)雪旺細(xì)胞和脂肪干細(xì)胞作為種子細(xì)胞，并進(jìn)一步地將它們引入絲素/膠原蛋白神經(jīng)支架中，以此來(lái)構(gòu)建組織工程化神經(jīng)。然后用于修復(fù)大鼠坐骨神經(jīng)

2、10mm缺損，術(shù)后12周行電生理學(xué)及形態(tài)分析學(xué)等一系列檢查評(píng)估神經(jīng)再生情況。
　　方法：
　　1.分離培養(yǎng)大鼠雪旺細(xì)胞（SCs），并行光鏡下形態(tài)觀察及雪旺細(xì)胞標(biāo)記物S-100免疫熒光染色鑒定；分離培養(yǎng)大鼠脂肪干細(xì)胞（ADSCs），并取其第3代行流式細(xì)胞儀分析，觀察其表型CD29、CD34、CD45、CD73、CD90和CD105表達(dá)情況；取第3代雪旺細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞按2∶1比例進(jìn)行共培養(yǎng)，每天倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化

3、。培養(yǎng)14天后，采用免疫熒光染色檢測(cè)MAP2、 NeuN和GFAP神經(jīng)特異標(biāo)志物表達(dá)情況。
　　2.絲素/膠原蛋白神經(jīng)支架的制備：以桑蠶絲和牛腱為原料制備絲素蛋白和膠原蛋白，將二者按質(zhì)量比為2∶1比例進(jìn)行共混，冷凍，真空干燥，制備絲素/膠原蛋白神經(jīng)復(fù)合支架。
　　3.組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建及性能檢測(cè)：將共培養(yǎng)的雪旺細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞引入絲素/膠原蛋白神經(jīng)支架構(gòu)建組織工程化神經(jīng)，掃描電鏡（SEM）觀察支架內(nèi)部結(jié)構(gòu)及細(xì)胞在內(nèi)部的生長(zhǎng)

4、增殖情況；采用 Instron5865力學(xué)試驗(yàn)機(jī)測(cè)其力學(xué)性能。
　　4.大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型的建立及不同神經(jīng)移植物修復(fù)神經(jīng)缺損：?jiǎn)渭兘z素/膠原支架移植組(Scaffold組)，組織工程化神經(jīng)移植組(TENC組)，自體神經(jīng)移植組(Autograft組)，未手術(shù)對(duì)照組（Normal組）。
　　5.術(shù)后12周行再生神經(jīng)大體觀察、免疫學(xué)檢測(cè)、電生理學(xué)檢測(cè)、形態(tài)學(xué)計(jì)量學(xué)分析。
　　結(jié)果：
　　1.成功分離及純化大鼠雪旺細(xì)胞

5、，經(jīng)3次傳代后，基本無(wú)雜質(zhì)細(xì)胞，純度較高；采用流式細(xì)胞儀分析結(jié)果表明第3代脂肪干細(xì)胞高表達(dá)CD29（91.81％）、CD90（88.22%）、CD73（99.78%）和 CD105（98.32%），低表達(dá)CD34（0.20%）和 CD45（0.72%）；雪旺細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)14天后可見原本呈梭形的脂肪干細(xì)胞以胞核為中心收縮，胞體折光性增強(qiáng)，胞體伸出多個(gè)長(zhǎng)而粗的突起，同時(shí)雪旺細(xì)胞細(xì)胞體積增大、周圍突起增粗。免疫熒光染色檢測(cè) MAP2

6、、NeuN和 GFAP不同程度陽(yáng)性表達(dá)。
　　2.掃描電鏡可見組織工程化神經(jīng)相通性好，在支架三維的孔隙中和表面上有許多神經(jīng)元樣細(xì)胞生長(zhǎng)且伸出長(zhǎng)的突起黏附于支架，細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好。支架最大和平均彈性模量分別為10.8±0.3 MPa，8.14±0.2 MPa。該彈性模量的大小完全可以抵抗移植后肌肉所產(chǎn)生的張力。
　　3.各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物都不同程度上實(shí)現(xiàn)缺損神經(jīng)的再生修復(fù)。但從實(shí)驗(yàn)動(dòng)物神經(jīng)修復(fù)效果來(lái)講，組織工程化神經(jīng)移植組和自體神經(jīng)

7、移植組都較為相似，都優(yōu)于單純絲素/膠原蛋白支架移植組。
　　結(jié)論：
　　1.雪旺細(xì)胞與脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)，兩者不僅能夠共生，而且雪旺細(xì)胞能顯著促進(jìn)脂肪干細(xì)胞向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化。
　　2.絲素、膠原作為兩種優(yōu)異的天然可降解材料，以合適的配比混合，集足夠的力學(xué)性能、良好的生物相容性及適宜的降解性于一體，為組織工程化神經(jīng)提供理想的載體。
　　3.絲素/膠原蛋白神經(jīng)支架聯(lián)合雪旺細(xì)胞-脂肪干細(xì)胞共培養(yǎng)所構(gòu)建的組織工程化神經(jīng)具