FFNT-5治療UUO模型大鼠腎纖維化實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、第一章不同濃度FFNT-5對(duì)腎成纖維細(xì)胞增殖的影響研究
　　 背景:腎間質(zhì)纖維化是由各種因?yàn)橐鸬募?xì)胞外基質(zhì)成分在腎間質(zhì)內(nèi)過度沉積,成纖維細(xì)胞是間質(zhì)內(nèi)主要腎臟固有細(xì)胞之一,是腎間質(zhì)纖維化過程中最主要的細(xì)胞外基質(zhì)分泌細(xì)胞,因此,能否阻止腎組織纖維化進(jìn)程關(guān)鍵在于能否阻斷腎成纖維細(xì)胞的過度增殖和分泌。腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生機(jī)制較為復(fù)雜、目前尚未完全闡明,可能與以下幾個(gè)方面有關(guān):間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖、活化和表型轉(zhuǎn)化；腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成

2、纖維細(xì)胞；某些血管活性物質(zhì)和細(xì)胞因子等對(duì)上述細(xì)胞生物學(xué)行為、細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生及降解過程的影響；細(xì)胞外基質(zhì)成分產(chǎn)生增多和(或)降解減少,最終導(dǎo)致腎間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)積聚和纖維化?；谀I間質(zhì)纖維化病理機(jī)制有多靶點(diǎn)與多環(huán)節(jié)的特點(diǎn),研究和開發(fā)一種有效的抗纖維化藥物已成為全球腎臟病領(lǐng)域的熱點(diǎn)、難點(diǎn)之一。氟非尼酮(1-(3-氟苯基)-5-甲基-2-(1H)吡啶酮,fluorofenidone,AKF-PD)是由中南大學(xué)自主設(shè)計(jì)合成的一種新的吡啶酮類化合物

3、,已獲得國家發(fā)明專利,前期已在GLP實(shí)驗(yàn)室證明其毒性低,在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)具有廣泛抗腎間質(zhì)纖維化的作用；N-5是本研究組合成得到的一種新的小分子化合物,在前期抗腎纖維化藥物篩選實(shí)驗(yàn)中我們初步發(fā)現(xiàn)FFNT-5可抑制腎成纖維細(xì)胞增長,因此我們?cè)跀M此基礎(chǔ)上來觀察不同濃度FFNT-5對(duì)腎成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　 目的:觀察FFNT-5對(duì)腎成纖維細(xì)胞增殖的影響。
　　 方法:采用噻唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度的FFN

4、T-5對(duì)鼠腎成纖維細(xì)胞(BHK-21)增殖的影響。設(shè)立正常對(duì)照組、FFNT-5(100μg/ml)組、FFNT-5(200μg/ml)組、FFNT-5(400μg/ml)組、AKF-PD(100μg/ml)組、AKF-PD(200μg/ml)組及AKF-PD(400μg/ml)組,分別于不同時(shí)間點(diǎn)(24、48、72小時(shí))用酶標(biāo)儀檢測(cè)OD值并在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)及生長狀況。
　　 結(jié)果:不同濃度FFNT-5作用于鼠腎成纖維

5、細(xì)胞24h、48h、72h時(shí)均能明顯抑制細(xì)胞增殖,并呈一定的濃度依賴性,各時(shí)間點(diǎn)觀察細(xì)胞形態(tài)無明顯變化。
　　 結(jié)論:FFNT-5可明顯抑制鼠腎成纖維細(xì)胞的增殖。
　　 第二章不同劑量FFNT-5對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的治療效果的觀察研究
　　 背景:腎間質(zhì)纖維化是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期腎衰竭的共同途徑和主要病理基礎(chǔ)；是在各種致病因子如損傷、炎癥、藥物、遺傳因素等的作用下,間質(zhì)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)增多,尤其是基

6、質(zhì)蛋白合成增加、基質(zhì)降解受抑制造成細(xì)胞外基質(zhì)的大量堆積導(dǎo)致的腎小球硬化和小管間質(zhì)的纖維化。積聚在腎間質(zhì)的細(xì)胞外基質(zhì)成分復(fù)雜,既包括正常腎間質(zhì)已有的機(jī)制蛋白成分(Ⅰ、Ⅲ、纖連蛋白和腱蛋白等)的增多,還包括正常時(shí)僅存在于腎小管基膜的基質(zhì)蛋白(Ⅳ型膠原和纖連蛋白等)的沉積。單側(cè)輸尿管梗阻(UUO)模型是目前研究腎間質(zhì)纖維化經(jīng)典的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型,通過結(jié)扎單側(cè)輸尿管引起腎臟引流系統(tǒng)的阻塞,導(dǎo)致急性腎臟功能的改變和慢性腎臟結(jié)構(gòu)的損害,模擬臨床上常見的

7、輸尿管梗阻導(dǎo)致的腎間質(zhì)損傷,且有操作簡單,易行,病變典型的特點(diǎn)。FFNT-5是本課題組合成得到的一種新的吡啶酮類化合物,前面的體外實(shí)驗(yàn)中已證實(shí)它能明顯抑制腎成纖維細(xì)胞的增殖,并呈一定的濃度依賴性,對(duì)正常細(xì)胞無明顯影響,前期完成了急性毒性試驗(yàn)研究,已在GLP實(shí)驗(yàn)室證明其毒性低。因此FFNT-5在體內(nèi)能否影響腎組織中膠原的沉積達(dá)到抗。腎纖維化的作用值得更進(jìn)一步研究。
　　 目的：觀察不同劑量FFNT-5對(duì)腎間質(zhì)纖維化的治療效果。

8、r>　　 方法：將25只SD雄性大鼠隨機(jī)分為5組:假手術(shù)組、模型組、FFNT-562.5mg/kg組、FFNT-5125mg/kg組及AKF-PD125mg/kg治療組,每組各5只。除假手術(shù)組外,其他各組行單側(cè)輸尿管結(jié)扎術(shù)建立輸尿管梗阻模型,假手術(shù)組只分離術(shù)側(cè)輸尿管,不予結(jié)扎及離斷。UUO造模前1天起予以灌胃至術(shù)后13天,各治療組藥物均以0.5％CMCNa作為溶劑,FFNT-562.5mg/kg治療組給與FFNT-5溶液62.5mg/

9、kg/d灌胃、FFNT-5125mg/kg治療組給與FFNT-5溶液125mg/kg/d灌胃；AKF-PD治療組給與AKF-PD溶液125mg/kg/d灌胃；模型組和假手術(shù)組每天給與等體積0.5％CMCNa灌胃。術(shù)后14天處死動(dòng)物,取各組大鼠的術(shù)側(cè)腎組織分別做HE和Masson染色,并用免疫組化方法檢測(cè)腎臟Ⅰ、Ⅲ膠原表達(dá)水平。
　　 結(jié)果：UUO術(shù)后14天,模型組大鼠腎間質(zhì)損傷指數(shù)和腎間質(zhì)纖維化程度較假手術(shù)組明顯升高(P＜0.0

10、001)；除FFNT-562.5mg/kg組外,余治療組與模型組相比損傷指數(shù)及纖維化程度均顯著下降(P＜0.0001),但仍高于假手術(shù)組(P＜0.05)；FFNT-5125mg/kg組療效弱于AKF-PD125mg/kg組(P＜0.05)；FFNT-562.5mg/kg至125mg/kg組隨著劑量的增大,腎間質(zhì)損傷指數(shù)及間質(zhì)纖維化程度逐步減低,呈劑量依賴性；模型組梗阻側(cè)腎組織Ⅰ、Ⅲ膠原表達(dá)顯著上調(diào)；FFNT-5藥物各治療組與模型組相比Ⅰ