蘆丁對(duì)UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的影響及作用機(jī)制的研究.pdf

1、目的:通過觀察蘆丁對(duì)單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstructive，UUO)大鼠腎間質(zhì)纖維化模型的腎臟組織病理及相關(guān)纖維化因子表達(dá)的影響，進(jìn)而探討蘆丁對(duì)腎間質(zhì)纖維化的保護(hù)作用及作用機(jī)制。
　　方法:1.UUO大鼠模型的建立及分組
　　SPF級(jí)成年雄性Wiatar大鼠，體重200-250g，共24只，隨機(jī)均分成4組:假手術(shù)組（Sham+Vehicle），假手術(shù)組+蘆丁治療組(Sham+Rutin

2、)，模型組(UUO+Vechicle)，蘆丁治療組（UUO+Rutin）。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，對(duì)模型組和蘆丁治療組大鼠行左側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO模型，假手術(shù)組大鼠僅游離左側(cè)輸尿管，不予結(jié)扎，其余麻醉及手術(shù)步驟一致。Sham+Rutin和UUO+Rutin兩組大鼠分別給予蘆丁100mg/(kg·d)溶于1％羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)溶液中灌胃;Sham+Vechicle和UUO+Vechicle兩組大鼠給予等量1％CMC-Na溶液。全部

3、大鼠于術(shù)后2周處死，一部分腎組織用4％多聚甲醛固定保存用于組織學(xué)檢測(cè)，其余腎組織用液氮速凍后保存于-80℃冰箱用于蛋白提取。
　　2.組織病理學(xué)觀察
　　組織標(biāo)本4％多聚甲醛固定、石蠟包埋后，取4μm切片脫蠟至水，按常規(guī)方法分別行HE和Masson染色。取HE、Masson染色切片，每例切片在高倍鏡下(200×)隨機(jī)觀察10個(gè)互不重疊腎小管間質(zhì)視野并拍照，分析腎臟間質(zhì)損傷及纖維化程度。
　　3.免疫組織化學(xué)染色

4、　　采用二步法免疫組化檢測(cè)系統(tǒng)。腎臟組織切片常規(guī)脫蠟水化，在檸檬酸鹽緩沖液中微波熱修復(fù)20min。依次予3％過氧化氫溶液孵育15min消除內(nèi)源性過氧化物酶，一抗4℃孵育過夜，試劑一37℃孵育20min，試劑二37℃孵育20-30min。PBS洗后用DAB顯色液顯色，中性樹膠封片后每張切片在顯微鏡下(200×)隨機(jī)觀察10個(gè)互不重疊視野并拍照，最后采用Image Pro Plus圖像分析軟件進(jìn)行半定量分析。
　　4.Western

5、Blot
　　腎臟組織經(jīng)勻漿、裂解、離心(12000rpm，4℃，15min)后，采用BCA法測(cè)定總蛋白濃度。吸取等量蛋白樣品(50ug)，經(jīng)過10％ SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF膜上，再依次經(jīng)封閉、一抗4℃孵育過夜、二抗室溫孵育1h以及化學(xué)發(fā)光顯影，最后采用Image J軟件對(duì)各條帶進(jìn)行半定量分析。
　　5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法
　　統(tǒng)計(jì)學(xué)分析應(yīng)用SPSS19.0軟件。全部計(jì)量資料數(shù)據(jù)表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（(

6、x)±s）。組間比較選用t檢驗(yàn)或單因素方差分析(One-Way ANOVA)，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果:1.組織病理學(xué)檢查結(jié)果:
　　HE染色結(jié)果顯示，假手術(shù)組和假手術(shù)+蘆丁治療組大鼠腎臟組織學(xué)正常。模型組大鼠可見嚴(yán)重腎間質(zhì)損傷，包括腎小管擴(kuò)張、萎縮以及小管上皮細(xì)胞空泡變性，腎間質(zhì)纖維化，腎間質(zhì)大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。腎間質(zhì)損傷評(píng)分顯示:與假手術(shù)比較，模型組腎間質(zhì)損傷明顯增加(P＜

7、0.001);與模型組比較，蘆丁治療組大鼠腎臟腎間質(zhì)損傷明顯減輕(P＜0.05)。
　　腎間質(zhì)纖維化程度采用Masson染色觀察。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎間質(zhì)可間明顯膠原沉積，而且腎間質(zhì)纖維化面積顯著增高(P＜0.001)。蘆丁治療組大鼠腎間質(zhì)膠原沉積明顯減少，腎間質(zhì)纖維化面積百分比分析顯著降低(P＜0.05)。
　　2.免疫組化染色結(jié)果
　　染色圖片及半定量分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟Collge

8、nⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA和CD68蛋白表達(dá)明顯增加(P＜0.001)，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.001);與模型組比較，蘆丁治療組腎大鼠腎臟間質(zhì)中ColgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA和CD68蛋白表達(dá)表達(dá)明顯減少(P＜0.05)，而E-cadherin蛋白表達(dá)相對(duì)增加(P＜0.05)。
　　3.Western Blot結(jié)果
　　Western blot免疫印記條帶及

9、半定量分析結(jié)果顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腎臟CollgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、CD68、TNF-α、IL-1β和p-NFκB蛋白表達(dá)均明顯增加(P＜0.001)，而E-cadherin蛋白表達(dá)明顯減少(P＜0.05);與模型組比較，蘆丁治療組大鼠腎臟CollgenⅠ/Ⅲ、Fibronectin、α-SMA、TGF-β1、p-Smad3、CD68、TNF-α、IL-1β和p-NF