水稻miR393與靶基因的精細(xì)表達(dá)模式及其在Auxin反應(yīng)通路中的作用.pdf

1、miR393是水稻中5大保守miRNA家族成員之一，通過(guò)調(diào)控編碼生長(zhǎng)素受體基因TIR1及AFB2表達(dá)影響Auxin信號(hào)通路，因此在植物的生長(zhǎng)發(fā)育與逆境脅迫等方面發(fā)揮重要的調(diào)控功能。然而，水稻miR393與其靶基因相互作用的精細(xì)時(shí)空特征尚不清楚。在本課題中我們主要利用啟動(dòng)子分析及表達(dá)變化轉(zhuǎn)基因株系，運(yùn)用環(huán)氧樹(shù)脂切片技術(shù)研究水稻miR393a、TIR1和DR5在根和胚芽鞘組織的精細(xì)表達(dá)模式，并利用過(guò)量和抑制miR393表達(dá)的轉(zhuǎn)基因株系對(duì)Au

2、xin反應(yīng)通路中相關(guān)基因家族轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行檢測(cè)和分析。獲得的主要結(jié)果如下:
　　1、miR393及其靶基因在根和胚芽鞘中的精細(xì)空間表達(dá)特征
　　通過(guò)對(duì)啟動(dòng)子株系的GUS染色及環(huán)氧樹(shù)脂切片，結(jié)果顯示在側(cè)根形成過(guò)程中，miR393a主要在側(cè)根基部的中柱組織、中柱鞘細(xì)胞以及內(nèi)皮層表達(dá);而靶基因TIR1在側(cè)根的這些部位并不表達(dá)，卻在側(cè)根基部與側(cè)根尖端之間的組織中強(qiáng)表達(dá)，呈現(xiàn)與miR393a表達(dá)的空間互補(bǔ)特征。主根根尖的切片結(jié)果顯示，T

3、IR1在除根尖外和表皮以外的皮層和中柱組織區(qū)域表達(dá)，而miR393a在根尖區(qū)域不表達(dá)。以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明在主根和側(cè)根組織中miR393a和靶基因TIR1的表達(dá)區(qū)域并不重疊，具有明顯的空間互補(bǔ)特征。
　　miR393a在胚芽鞘尖端強(qiáng)表達(dá)，而TIR1在胚芽鞘中并不表達(dá)，呈現(xiàn)出與主根中相反的表達(dá)特征。
　　此外，檢測(cè)生長(zhǎng)素反應(yīng)的DR5活性在側(cè)根基部的中柱組織、中柱鞘細(xì)胞、內(nèi)皮層、側(cè)根尖端、主根的中柱組織以及胚芽鞘尖端都很強(qiáng)烈，說(shuō)明水

4、稻miR393a與靶基因TIR1的轉(zhuǎn)錄活性部位位于Auxin反應(yīng)強(qiáng)烈的區(qū)域內(nèi)，與Auxin反應(yīng)密切相關(guān)。利用miR393a抑制表達(dá)的MIM393株系進(jìn)行DR5活性觀察，發(fā)現(xiàn)在MIM393株系的側(cè)根形成過(guò)程及主根的不同區(qū)段，Auxin反應(yīng)增強(qiáng)，說(shuō)明抑制miR393a對(duì)靶基因的剪切作用能增強(qiáng)側(cè)根及主根的Auxin反應(yīng)。
　　2、Auxin反應(yīng)相關(guān)基因家族的表達(dá)模式
　　我們運(yùn)用qRT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)正常萌發(fā)2天的水稻幼苗各組

5、織中Auxin反應(yīng)相關(guān)基因的表達(dá)模式。結(jié)果顯示:1）生長(zhǎng)素合成相關(guān)的YUC家族主要在胚芽鞘、幼葉及根中強(qiáng)表達(dá)，胚芽鞘中YUC2表達(dá)量最高，幼葉及根中YUC6表達(dá)量最高。2）生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)的LAX家族在胚芽鞘，根以及幼嫩葉片中強(qiáng)表達(dá)，并且表達(dá)量最高的為L(zhǎng)AX5。3）生長(zhǎng)素分解相關(guān)的GH3家族主要在胚芽鞘中強(qiáng)表達(dá)，其中GH12表達(dá)量最高。4)IAA家族主要在胚芽鞘及根中表達(dá)，其中IAA11、IAA12、IAA14、IAA16和IAA31在胚

6、芽鞘中強(qiáng)表達(dá);IAA23在根中表達(dá)量最高。5) ARF家族主要在胚芽鞘及根中表達(dá)，其中ARF6、ARF10、ARF16及ARF21在胚芽鞘中強(qiáng)表達(dá);ARF7A在根中表達(dá)量最高。上述結(jié)果表明，涉及Auxin合成、運(yùn)輸、分解及下游的ARF反應(yīng)基因在胚芽鞘以及幼根中表達(dá)活躍。
　　3、OsmiR393表達(dá)水平對(duì)Auxin反應(yīng)相關(guān)基因家族表達(dá)的影響
　　通過(guò)檢測(cè)過(guò)表達(dá)MIR393(OE)株系及抑制MIR393(MIM393)株系胚芽

7、鞘與根中Auxin途徑各基因家族的表達(dá)情況，主要發(fā)現(xiàn)miR393促進(jìn)胚芽鞘中Auxin合成相關(guān)基因YUC1、YUC2、YUC3和YUC4以及生長(zhǎng)素分解相關(guān)基因GH3-5和GH-12的顯著上調(diào)，而生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)基因LAX1、LAX2和LAX3的顯著下調(diào)。而在幼根中,miR393最明顯的作用是引起生長(zhǎng)素運(yùn)輸相關(guān)基因的極顯著下調(diào)。
　　綜上所述，水稻miR393a與靶基因TIR1表達(dá)位點(diǎn)具有精細(xì)的空間特異性，miR393能影響涉及Aux