miR-29及其靶基因COLI在增生性瘢痕形成中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、背景：增生性瘢痕（HS）是皮膚創(chuàng)傷愈合過(guò)程中常見(jiàn)的并發(fā)癥，發(fā)生率高達(dá)4~16％，嚴(yán)重影響組織功能恢復(fù)和外觀。膠原的合成與降解代謝失衡是 HS形成的根本原因，但導(dǎo)致膠原持續(xù)過(guò)度合成的病因?qū)W與分子機(jī)制尚不十分明確，臨床上對(duì) HS的治療是一大臨床挑戰(zhàn)。盡管采用了許多治療方法，但其治療效果卻不盡相同。因此，需要探尋新的治療靶點(diǎn)。在前期的研究中，基因芯片檢測(cè)顯示，正常皮膚(NS)組織和HS組織中microRNA（miRNA）分子的表達(dá)存在明顯差異

2、，這些 miRNA分子所調(diào)節(jié)的靶基因涵蓋了細(xì)胞生命活動(dòng)的多個(gè)方面，如細(xì)胞凋亡與增殖、周期與運(yùn)動(dòng)、合成與代謝，其中miR-29的差異最明顯。而目前有研究認(rèn)為，miR-29可以在轉(zhuǎn)錄后水平抑制膠原的合成，從而在多種纖維化疾病的發(fā)生中起重要的調(diào)控作用。但miR-29與HS形成關(guān)系的研究尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。因此，我們推測(cè)，持續(xù)低水平表達(dá)的 miR-29喪失了對(duì)COLI基因表達(dá)的有效調(diào)控，進(jìn)而導(dǎo)致膠原為主的細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的過(guò)度沉積，最終形成HS

3、。如果施用正義miR-29提高HS局部組織中miR-29表達(dá)水平，將有可能成功抑制組織的過(guò)度纖維化過(guò)程，為HS的臨床防治提供新的靶點(diǎn)。
　　目的：通過(guò) miRNA表達(dá)譜芯片篩選出HS組織及NS組織中顯著差異表達(dá)的miRNA分子，探討miR-29通過(guò)在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控其靶基因COLI表達(dá)從而影響HS形成的作用機(jī)制，以期為HS的生物學(xué)治療提供新的靶點(diǎn)。
　　方法：
　　1.收集HS組織和NS組織標(biāo)本，經(jīng)過(guò)HE染色后證明所取臨

4、床標(biāo)本符合實(shí)驗(yàn)需要。分離并培養(yǎng)人 HS及 NS原代成纖維細(xì)胞。通過(guò) miRNA基因芯片篩選出 HS及NS中差異表達(dá)的miRNA分子，并采用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè) miR-29下游靶基因。
　　2.進(jìn)一步使用熒光定量PCR方法及western blot法明確人NS與HS中miR-29c及COLI基因的差異性表達(dá)，并采用卡方檢驗(yàn)或Fisher精確檢驗(yàn)進(jìn)行分析，探討miR-29與COLI基因表達(dá)水平的相關(guān)性；
　　3.構(gòu)建COLI A

5、1-3’UTR及其3種突變體的重組熒光素酶報(bào)告基因載體，分析正常成纖維細(xì)胞和瘢痕成纖維細(xì)胞中 COLI A1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體活性是否存在顯著差異，miR-29c模擬劑是否能顯著降低報(bào)告載體的活性，從而驗(yàn)證 COLI是否為miR-29c下游的有效靶基因。
　　4.構(gòu)建和包裝人 miR-29c過(guò)表達(dá)腺病毒，分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的 NS成纖維細(xì)胞及 HS成纖維細(xì)胞，采用流式細(xì)胞分析法及CCK-8法檢測(cè)HS成纖維細(xì)胞在感染腺病毒過(guò)表達(dá)

6、miR-29c后，細(xì)胞的增殖與凋亡是否受到顯著影響。
　　結(jié)果：
　　1.收集的HS和NS組織標(biāo)本經(jīng)過(guò)HE染色后均證明符合實(shí)驗(yàn)需要。免疫熒光染色鑒定HS組織及NS組織原代培養(yǎng)所得的細(xì)胞確實(shí)為成纖維細(xì)胞；
　　2.基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，HS組織中 miR-143、miR-32、miR-92b及 miR-25等45個(gè)miRNA的表達(dá)水平與NS組織相比上調(diào)，同時(shí)miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、

7、miR-195等68個(gè)miRNA顯著表達(dá)下調(diào)，提示它們可能在HS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。其中，miR-29的改變最為顯著，在12個(gè)HS樣本中miR-29分子表達(dá)均顯著低于NS組織（平均降低15.3倍）。
　　3.熒光定量PCR方法對(duì)篩選出的miRNA-29在HS及NS組織中的表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)論是在組織中還是原代成纖維細(xì)胞中，miR-29c在 HS中的表達(dá)顯著低于NS組織。而miRNA-29家族的其他成員在HS/NS

8、中的表達(dá)量均無(wú)顯著差異。
　　4.應(yīng)用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及軟件對(duì)miR-29靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，初步推測(cè)COLI是miR-29可能的靶基因。熒光定量PCR及Western Blot檢測(cè)表明COLI基因在NS組織中的表達(dá)量顯著低于HS組織，COLI在HS組織及NS組織原代培養(yǎng)所得的成纖維細(xì)胞中的表達(dá)量與組織中表達(dá)趨勢(shì)相符，卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)，無(wú)論在 HS及 NS組織中還是在原代培養(yǎng)的成纖維細(xì)胞中，miR-29與 COLI基因表達(dá)水平均具有顯

9、著負(fù)相關(guān)性。
　　5.構(gòu)建了 COLI基因及 miR-29c相應(yīng)結(jié)合區(qū)的突變體熒光素酶報(bào)告基因載體，酶切及測(cè)序證實(shí)構(gòu)建成功。熒光素酶活性的檢測(cè)結(jié)果顯示：瘢痕成纖維細(xì)胞中，COLI A1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體活性顯著高于正常成纖維細(xì)胞。在正常成纖維細(xì)胞及增生性瘢痕成纖維細(xì)胞中，miR-29c模擬劑均能有效降低COLI A1-3’UTR熒光素酶報(bào)告載體活性，卻不能有效降低其突變體的熒光素酶報(bào)告載體活性。進(jìn)一步說(shuō)明 miR-29c

10、可直接作用于COLI A1-3’UTR從而發(fā)揮作用。
　　6.成功構(gòu)建和包裝人miR-29c過(guò)表達(dá)腺病毒后，分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的NS成纖維細(xì)胞及HS成纖維細(xì)胞，采用定量PCR結(jié)合WB檢測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-29過(guò)表達(dá)后COLI基因表達(dá)顯著受到抑制，細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)及流式細(xì)胞分析發(fā)現(xiàn) miR-29過(guò)表達(dá)后成纖維細(xì)胞的增殖率顯著提高而凋亡率顯著下降。
　　結(jié)論：
　　1.基因芯片技術(shù)篩選發(fā)現(xiàn)，HS組織中 miR-143、miR-32、miR

11、-92b及miR-25等45個(gè)miRNA的表達(dá)水平與NS組織相比上調(diào)，同時(shí)miR-29a、miR-29b、miR-29c、miR-713、miR-195等68個(gè)miRNA顯著表達(dá)下調(diào)，提示它們可能在HS的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮作用。其中，miR-29的表達(dá)差異最為顯著。
　　2.在無(wú)論是組織還是細(xì)胞， miR-29c在HS中的表達(dá)均顯著低于NS，降低HS成纖維細(xì)胞中miR-29c的表達(dá)可以促進(jìn)其增殖并抑制其凋亡，提示miR-29在HS