葉酸對(duì)糖尿病大鼠心血管系統(tǒng)AGEs-RAGE及VCAM-1表達(dá)的影響.pdf

1、背景與目的： 糖尿病(diabetes mellitus，DM)是一組由遺傳和環(huán)境因素相互作用所致的臨床綜合征，其各種慢性并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，是多種因子相互作用的結(jié)果。隨著糖尿病發(fā)病率的增高及病程的發(fā)展，糖尿病心血管并發(fā)癥發(fā)生率越來(lái)越高，并已成為糖尿病患者死亡的主要原因之一。糖尿病心血管系統(tǒng)并發(fā)癥包括糖尿病性心肌病(diabetic cardiomyopathy，DCM)和糖尿病心臟大血管病變。DCM是糖尿病性心臟病的特異

2、性病變，是一種獨(dú)立的糖尿病并發(fā)癥，而糖尿病大血管病變最常見(jiàn)的改變是血管發(fā)生動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)改變。高糖環(huán)境下產(chǎn)生的高級(jí)糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)及其受體(receptor for AGEs，RAGE)成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)，AGEs與RAGE相互作用可以激活某些關(guān)鍵的細(xì)胞信號(hào)傳遞途徑，誘導(dǎo)多種氧自由基以及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，引起血管內(nèi)皮損傷、血流

3、動(dòng)力學(xué)和血液流變學(xué)異常、細(xì)胞基質(zhì)異常增生以及新生血管形成等一系列病理變化，從而促進(jìn)糖尿病心血管并發(fā)癥的發(fā)生。近年來(lái)有關(guān)AS機(jī)制的研究發(fā)現(xiàn)，AS是一組包括慢性炎癥在內(nèi)的多因素疾病…，其分子基礎(chǔ)在于白細(xì)胞與血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(vascular cell adhesion molecule，VCAM)的相互作用，其中VCAM-1在AS的發(fā)生發(fā)展中起著重要的橋梁作用。高同型半胱氨酸血癥(hyperhomocysteirlemia，HHcy)是

4、糖尿病患者的重要獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一，研究證實(shí)HHcy可通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮作用而對(duì)心血管系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重危害。HHcy患者往往伴有葉酸、維生素B<,12>等的缺乏，許多研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)充葉酸和/或維生素B<,12>可以降低糖尿病患者血清中的同型半胱氨酸濃度。目前國(guó)內(nèi)有利用高蛋氨酸(Met)喂飼大鼠所引起的HHcy模型補(bǔ)充葉酸和/或維生素B<,12>進(jìn)行研究的，但對(duì)于鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型葉酸干預(yù)后AGEs

5、-RAGE系統(tǒng)和VCAM-1的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。STZ誘導(dǎo)的糖尿病模型補(bǔ)充葉酸后，通過(guò)降低血同型半胱氨酸濃度，是否會(huì)對(duì)AGEs-RAGE系統(tǒng)及反應(yīng)炎癥浸潤(rùn)的VCAM-1因子的表達(dá)產(chǎn)生一定的影響呢?因此，本課題設(shè)計(jì)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型中補(bǔ)充葉酸來(lái)觀察其對(duì)糖尿病心肌及主動(dòng)脈組織上的AGEs-RAGE和VCAM-1表達(dá)的影響，為探討糖尿病心血管系統(tǒng)并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制及臨床治療提供新的思路和啟示。 方法：1、研究對(duì)象：wistar雄性大

6、鼠，50只，體重為200～250g，除正常對(duì)照組(N組，9只)外，其余41只大鼠為實(shí)驗(yàn)組，給予STZ單次腹腔注射，誘發(fā)糖尿病模型。正常對(duì)照組給予同等劑量的檸檬酸鹽緩沖液。然后將成模實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為糖尿病組(DM組，16只)和葉酸治療組(FA組，14只)。其中11只大鼠在飼養(yǎng)過(guò)程中因感染、酮癥等原因死亡已被剔除。 2、研究方法：①動(dòng)物成模2周后FA組給予葉酸5.0 mg/Kg體重灌服，N組和DM組分別給予同等體積的生理鹽水灌服。②

7、大鼠每周測(cè)定隨機(jī)體重與血糖。④采用HE及PAS染色方法光鏡下觀察心肌和主動(dòng)脈形態(tài)變化及糖原陽(yáng)性表達(dá)情況。⑤AGEs測(cè)定將液氮中的心肌和主動(dòng)脈組織制成3μm冰凍切片，用熒光顯微鏡觀察，記錄曝光時(shí)間，以此間接反映心肌和主動(dòng)脈組織AGEs含量。⑥分別采用免疫組化和免疫熒光方法檢測(cè)心肌和主動(dòng)脈組織切片中的VCAM-1和RAGE的表達(dá)情況。采用德國(guó)Leica Qwin V3圖像分析軟件，測(cè)量免疫組化切片陽(yáng)性細(xì)胞的平均灰度值和陽(yáng)性細(xì)胞率。并且采集免

8、疫熒光切片圖片，半定量分析其陽(yáng)性細(xì)胞的平均熒光表達(dá)程度。 3、統(tǒng)計(jì)分析：所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±SD)表示。樣本均數(shù)組間的比較用One-way ANOVA(單因素方差分析)方法，方差齊性用Student-Newman-Keuls檢驗(yàn)(Q檢驗(yàn))，方差不齊用Famtlane’s T2檢驗(yàn)。上述統(tǒng)計(jì)過(guò)程均采用SPSSl3.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。 結(jié)果： 1、大鼠隨機(jī)血糖、體重及8周末糖化血紅蛋白(GHb)測(cè)定：DM

9、組和FA組糖尿病大鼠在病程第4、6、8周，血糖較N組明顯升高(P<0.01)，體重下降(P<0.01或P<0.05)，糖尿病大鼠兩組間相比，血糖及體重均無(wú)明顯差別(P>0.05)。8周時(shí)糖尿病組同N組比較GHb明顯升高(P<0.01)，而FA組與DM組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。 2、心肌及主動(dòng)脈中AGEs的熒光測(cè)定分析：在病程8周時(shí)N組的心肌及主動(dòng)脈組織AGEs熒光強(qiáng)度最低(曝光時(shí)間最長(zhǎng))，DM組與N組比較熒光強(qiáng)

10、度明顯增高(P<0.05)；FA組的AGEs熒光強(qiáng)度較N組亦明顯升高(P<0.05)，但較DM組明顯降低(P<0.05)。 3、心肌及主動(dòng)脈中VCAM-1的表達(dá)分析：(1)定位表達(dá)：①8周末N組和FA組在大鼠心肌組織中可檢測(cè)到少量VCAM-1的表達(dá)，而DM組在8周末檢測(cè)到VCAM-1的表達(dá)明顯增加。陽(yáng)性表達(dá)位于主要在心內(nèi)膜的心肌胞漿，心外膜及血管周?chē)嗫蓹z測(cè)到。②N組和FA組8周末在主動(dòng)脈弓組織中均可檢測(cè)到VCAM-1的表達(dá)，

11、DM組在8周末檢測(cè)到VCAM-1的表達(dá)明顯增加。陽(yáng)性表達(dá)在動(dòng)脈內(nèi)膜的各層均可檢測(cè)到，但以彈性中膜表達(dá)量變化最大。(2)定量分析：①8周末，DM組與FA組心肌VCAM一1染色陽(yáng)性細(xì)胞率比N組明顯升高而平均灰度值降低(P

12、胞率降低而灰度值明顯升高(P<0.05)。 4、心肌及主動(dòng)脈中RAGE的表達(dá)分析：①8周末N組在大鼠心肌組織中僅有少量RAGE熒光的表達(dá)，DM組在8周末檢測(cè)到大量RAGE的表達(dá)，而FA組可檢測(cè)到RAGE的表達(dá)。②8周末N組在大鼠主動(dòng)脈弓組織中無(wú)RAGE的表達(dá)，DM組可檢測(cè)到大量RAGE的表達(dá)，F(xiàn)A組幾乎無(wú)RAGE的表達(dá)。 結(jié)論： 1、糖尿病大鼠接受葉酸治療后，糖尿病受損的心肌及主動(dòng)脈組織結(jié)構(gòu)有明顯的改善。