NSAIDS藥萘普生鈉可通過ERK途經(jīng)促進乳腺癌細胞的凋亡.pdf

1、ERK信號途徑的激活與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，ERK是一種與細胞增殖和凋亡相關(guān)的重要信號蛋白，也是控制乳腺癌進展的關(guān)鍵點。ERK通過磷酸化抗凋亡分子，同時激活轉(zhuǎn)錄因子以刺激表達存活相關(guān)基因而產(chǎn)生抗凋亡作用，同時ERK通過磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，最終調(diào)節(jié)細胞代謝和功能，影響細胞產(chǎn)生特定的生物學效應(yīng)。NSAIDs是一類廣泛應(yīng)用于臨床的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，其作用機

2、制是抑制環(huán)氧合酶，阻斷花生四烯酸（arachidonic acid，AA）前列腺素（prostaglandins，PGs）的生物合成，從而發(fā)揮其抗炎作用。本研究通過觀察不同濃度的萘普生鈉對體外培養(yǎng)的乳腺癌細胞的凋亡情況，明確該藥物對乳腺癌細胞的促凋亡作用，同時通過Western blot方法檢測ERK及P-ERK的表達，明確藥物促凋亡作用的途徑和方式。
　　 材料和方法：
　　 一、材料
　　 細胞株MDA-MB

3、-231和MCF-7人乳腺癌細胞株為中國醫(yī)科大學病理學教研室凍存。
　　 二、主要試劑
　　 濃縮型兔抗人ERK1/2單抗（L352）購于美國Bioworld公司，濃縮型兔抗人P-ERK1/2單抗（Y204）購于美國Bioworld公司。濃縮型辣根酶標記的羊抗兔抗體（BS10350）購于美國Bioworld公司。
　　 流式細胞儀試劑盒購于欣博盛公司。
　　 萘普生鈉購于山西普德藥業(yè)有限公司。
　　

4、 三、實驗方法
　　 （一）細胞培養(yǎng)和分組
　　 分別培養(yǎng)乳腺癌細胞MCF-7和MDA-MB-231，兩種乳腺癌細胞各分為四組，分別為對照組、低濃度藥物處理組、中等濃度藥物處理組和高濃度藥物處理組。對照組、低濃度藥物處理組、中等濃度藥物處理組和高濃度藥物處理組分別對應(yīng)藥物濃度為0mmol/L、1mmol/L、5mmol/L，和10mmol/L。
　　 （二）流式細胞儀檢測凋亡
　　 采用Annexin

5、V/PI雙染色法，流式細胞儀（BD FACScalibur）分析，結(jié)果采用Cellquest軟件分析處理。
　　 （三）Western blot
　　 常規(guī)收集不同濃度萘普生鈉作用24 h后的MDA-MB-231及MCF-7乳腺癌細胞，冷凍離心取上清液分裝，Bradford法測定細胞提取物的蛋白濃度。以特異性識別雙磷酸化ERK1/2的抗體檢測磷酸化ERK1/2的量；以抗總ERK1/2抗體檢測總ERK1/2的量為內(nèi)對照。用

6、SDS-PAGE電泳結(jié)束后，將PVDF膜放入封閉緩沖液，室溫封閉1 h，加入兔抗人ERK-1/2抗體及兔抗人P-ERK抗體，過夜，加入HRP標記的羊抗兔IgG，將Western印跡試劑均勻涂于PVDF膜上，傾去發(fā)光試劑，用保鮮膜蓋于PVDF膜上一暗室內(nèi)將x線片置于保鮮膜上，沖洗x線片，拍照及進行計算機圖像分析，應(yīng)用BandScar5.0軟件進行結(jié)果灰度值檢測。
　　 （四）統(tǒng)計學分析
　　 應(yīng)用SPSS12.0統(tǒng)計軟件進

7、行統(tǒng)計分析，采用t檢驗方法分析各組Western blot圖像灰度值和流式細胞儀凋亡率，P<0.05為具有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1、流式細胞儀結(jié)果
　　 MCF-7和MDA-MB-231兩組間比較P>0.05，未見統(tǒng)計學差異；不同濃度藥物處理各組間P<0.05，具有顯著性統(tǒng)計學差異；同時藥物濃度與細胞凋亡率具有明顯相關(guān)性。
　　 2、Western blot結(jié)果
　　 不同藥物濃度各組

8、間ERK表達比較P>0.05，未見統(tǒng)計學差異，而P-ERK表達則P<0.05，具有顯著性統(tǒng)計學差異，同時藥物濃度與P-ERK表達具有明顯負相關(guān)。
　　 討論：
　　 ERK1/2是由Boulton等于90年代初期先后分離鑒定的一種蛋白激酶，ERK可通過磷酸化反應(yīng)可調(diào)節(jié)某些轉(zhuǎn)錄因子的活性，這些轉(zhuǎn)錄因子進一步調(diào)節(jié)它們各自靶基因的轉(zhuǎn)錄，引起特定蛋白的表達或活性改變，最終調(diào)節(jié)細胞代謝和功能，影響細胞產(chǎn)生特定的生物學效應(yīng)。ERK信

9、號途徑的激活與腫瘤的發(fā)生有密切關(guān)系，ERK是一種與細胞增殖和凋亡相關(guān)的重要信號蛋白，也是控制乳腺癌進展的關(guān)鍵點。MAPK信號轉(zhuǎn)導通路參與多種細胞功能的調(diào)控，尤其是在細胞增殖、分化與凋亡中，起著關(guān)鍵作用。本研究證實乳腺癌細胞凋亡與P-ERK的表達具有明顯相關(guān)性，而與ERK的表達沒有明顯相關(guān)性，表明ERK磷酸化途徑是乳腺癌細胞抗凋亡的關(guān)鍵途徑之一。NSAIDs是一類廣泛應(yīng)用于臨床的解熱鎮(zhèn)痛抗炎藥，近年來，關(guān)于NSAIDs的抗腫瘤的作用，已經(jīng)

10、成為人們的研究熱點。本研究通過不同藥物濃度處理乳腺癌細胞觀察，發(fā)現(xiàn)萘普生鈉具有明顯的乳腺癌細胞的促凋亡作用，并且該作用隨藥物濃度的增加而增強。通過對雌激素受體陽性MCF-7和雌激素受體陰性MDA-MB-231乳腺癌細胞的ERK及P-ERK表達檢測，發(fā)現(xiàn)萘普生鈉對兩種細胞ERK的表達沒有明顯的影響，而對P-ERK的表達具有顯著的抑制作用，同時該抑制作用隨藥物濃度的增加而增強，具有明顯的相關(guān)性，與雌激素受體無相關(guān)性，從而表明萘普生鈉可通過抑