癌相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAF)通過(guò)調(diào)控整合素β3促進(jìn)人乳腺癌細(xì)胞的遷移.pdf

1、目的：研究癌相關(guān)成纖維細(xì)胞（CAF）對(duì)乳腺癌細(xì)胞遷移功能的影響及其分子機(jī)制。
　　方法：采用生物信息學(xué)手段分析課題組前期 MCF-10A/Twist和MCF-10A/Vector細(xì)胞的mRNA與蛋白芯片數(shù)據(jù)，研究整合素家族的表達(dá)情況。運(yùn)用qRT-PCR法檢測(cè)ITGB3基因在正常乳腺組織、原位導(dǎo)管癌、浸潤(rùn)性乳腺癌和轉(zhuǎn)移性乳腺癌臨床樣本中的表達(dá)。利用 qRT-PCR和western blot的方法篩選內(nèi)源性高表達(dá)ITGB3基因的乳腺癌

2、細(xì)胞系。將ITGB3-shRNA包裝到慢病毒中，構(gòu)建穩(wěn)定干擾ITGB3基因表達(dá)的BT549、Hs578T細(xì)胞模型，并利用qRT-PCR和western blot驗(yàn)證ITGB3的表達(dá)。Transwell法檢測(cè)ITBG3穩(wěn)定干擾細(xì)胞模型的遷移能力的改變。將穩(wěn)定干擾ITGB3的細(xì)胞分別與NF、CAF進(jìn)行共培養(yǎng)，Transwell法和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力的改變。在MCF-7和SK-BR-3細(xì)胞中過(guò)表達(dá)ITGB3，采用western blot進(jìn)

3、行驗(yàn)證。將過(guò)表達(dá)ITGB3基因的細(xì)胞與NF、CAF進(jìn)行共培養(yǎng)，Transwell法檢測(cè)其遷移能力的改變。分析前期NF與 CAF mRNA芯片數(shù)據(jù)，篩選出其中差表達(dá)的分泌因子，并用qRT-PCR和 ELISA驗(yàn)證芯片結(jié)果。用Kaplan-meier法分析分泌因子CCL18的表達(dá)與乳腺癌預(yù)后的關(guān)系。qRT-PCR檢測(cè)從臨床乳腺癌樣本中分離出的NF及CAF中CCL18的表達(dá)情況。CO-IP檢測(cè)CCL18與ITGB3相互作用的情況。利用siRN

4、A干擾CAF中CCL18的表達(dá)，采用qRT-PCR、western blot和ELISA法進(jìn)行驗(yàn)證。干擾CCL18的CAF與干擾ITGB3的細(xì)胞模型進(jìn)行共培養(yǎng)，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。在 CAF的無(wú)血清條件培養(yǎng)基中加入 CCL18的中和抗體，再與穩(wěn)定干擾ITGB3的細(xì)胞共培養(yǎng)，Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的改變。將分泌因子CCL18直接與ITGB3干擾細(xì)胞模型共培養(yǎng)，Transwell法檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化。

5、利用western blot檢測(cè)CCL18作用于ITGB3后所激活的下游信號(hào)通路和遷移相關(guān)蛋白E-cadherin及Vimentin的表達(dá)。CCL18作用于BT549細(xì)胞，同時(shí)抑制下游信號(hào)通路p38/MAPK的活化，Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力的變化，western blot檢測(cè)E-cadherin及Vimentin的表達(dá)情況。
　　結(jié)果：整合素家族在MCF-10A/Twist細(xì)胞中表達(dá)異常，ITGB3基因在乳腺癌臨床樣本中

6、的表達(dá)水平隨著腫瘤惡性程度的增加而升高。BT549、Hs578T是內(nèi)源性高表達(dá)ITGB3的細(xì)胞系，MCF-7、SK-BR-3是低表達(dá)ITGB3的細(xì)胞系。成功構(gòu)建ITGB3穩(wěn)定干擾的BT549、Hs578T細(xì)胞模型和ITGB3過(guò)表達(dá)的MCF-7、SK-BR-3細(xì)胞模型。CAF能夠促進(jìn)ITGB3陽(yáng)性表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞遷移，但NF無(wú)該現(xiàn)象。CAF異常高表達(dá)的分泌因子CCL18,其表達(dá)水平與乳腺癌的不良預(yù)后成正相關(guān)。臨床樣本顯示CAF中CCL18

7、的表達(dá)水平明顯高于NF并且CCL18能夠與ITGB3發(fā)生相互作用。CAF中干擾CCL18表達(dá)或者CAF條件培養(yǎng)基中加入CCL18中和抗體后，CAF促ITGB3陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞的遷移能力降低。ITGB3陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞中加入CCL18，細(xì)胞的遷移能力上調(diào)。CCL18作用于 ITGB3后激活下游 p38/MAPK信號(hào)通路，并且抑制E-cadherin表達(dá)，促進(jìn)Vimentin表達(dá)。
　　結(jié)論：CAF能夠產(chǎn)生分泌因子CCL18，CCL18能夠